王 燕，劉會(huì)杰，馬弘財(cái)，曾江勇，元振杰

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009）

沙門氏菌是一種可以引起人和動(dòng)物腹瀉的病原菌，也是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，禽蛋、家禽和肉類產(chǎn)品是其主要傳播媒介，人類食入被沙門氏菌污染的食品，可引發(fā)公共衛(wèi)生事件，因此做好沙門氏菌流行調(diào)研、分離鑒定，了解其血清型分布，具有重要的公共衛(wèi)生意義。血清型是沙門氏菌的重要分類依據(jù)[1-2]，是研究沙門氏菌流行情況和進(jìn)行公共衛(wèi)生檢測(cè)的重要參數(shù)，及時(shí)了解和掌握養(yǎng)殖動(dòng)物中的沙門氏菌血清型分布，對(duì)研究沙門氏菌流行態(tài)勢(shì)及其追蹤溯源具有重要價(jià)值[3]。

沙門氏菌血清型由菌體抗原（O）、鞭毛抗原（H）和莢膜抗原（Vi）決定，而O和H抗原是絕大部分沙門氏菌屬血清型鑒定的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。本研究選擇拉薩市養(yǎng)雞業(yè)相對(duì)集中的城關(guān)區(qū)、曲水縣、達(dá)孜縣、墨竹工卡縣、堆龍區(qū)5個(gè)縣（區(qū)），選擇12個(gè)具有代表性的規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)進(jìn)行采樣檢測(cè)，開展沙門氏菌分子生物學(xué)鑒定，并利用菌體抗原（A-F）診斷血清，做雞源沙門氏菌血清分型試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)計(jì)致病性試驗(yàn)，以期為西藏地區(qū)沙門氏菌病防控提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱：美國(guó)SHELLAB公司，型號(hào)SMI7-2；生物安全柜：青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司，型號(hào)HR40-IIA2；全自動(dòng)純水儀：四川優(yōu)普超純科技有限公司，型號(hào)UPS-III-40；

高速冷凍離心機(jī)：Thermo Fisher，型號(hào)ST40 ST40R；PCR儀：BIO-RAD，型號(hào)C1 000 TM Thermal Cycler；電泳設(shè)備：BIO-RAD；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)：BIO-RAD，型號(hào)Gel Doc XR+；光學(xué)顯微鏡：Leica，型號(hào)DM3000 LED；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：CIRRUS-250。

1.2 主要試劑

沙門氏菌快速鑒別培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、伊紅美蘭腸桿菌、BS瓊脂培養(yǎng)基：購(gòu)自青島海博生物公司；沙門氏菌生化編碼微量鑒定管：購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；沙門氏菌菌體抗原（A-F）診斷血清：購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：西藏農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室提供；PCR反應(yīng)試劑：購(gòu)自寶生物公司。

1.3 被檢樣品

2017年3—4月，采集于拉薩市城關(guān)區(qū)、曲水縣、達(dá)孜縣、墨竹工卡縣、堆龍德慶縣12個(gè)集約化養(yǎng)雞場(chǎng)的疑似沙門氏菌病發(fā)病雞樣品，共計(jì)121份。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

對(duì)病死雞，解剖后采集病變組織；對(duì)發(fā)病商品雞和種雞，采集泄殖腔拭子；對(duì)環(huán)境用具等，采集表面拭子。采用無(wú)菌操作，取待檢樣品分別接種于沙門氏菌快速鑒別平板、麥康凱平板、伊紅美蘭平板、BS瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，觀察結(jié)果[4]。

2.2 細(xì)菌染色鏡檢

分別挑取單個(gè)可疑菌落，固定并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢[5]。

2.3 生化鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版和沙門氏菌編碼生化鑒定管說(shuō)明書要求，挑取培養(yǎng)好的新鮮菌落或菌液分別接種于賴氨酸脫羧酶、靛基質(zhì)、尿素酶、氰化鉀、硫化氫、山梨醇、甘露醇、水楊苷、丙二酸鹽、衛(wèi)矛醇、ONPG及葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、阿拉伯糖生化鑒定管，37 ℃恒溫培養(yǎng)1 d[6-7]，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

2.4 血清型鑒定

接照沙門氏菌屬診斷血清說(shuō)明書要求，首先將沙門氏菌接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，離心后用滅菌生理鹽水稀稀至規(guī)定濃度，取1滴沙門氏菌A-F診斷血清滴于潔凈的玻片上，再加入1滴制備的沙門氏菌液，搖動(dòng)玻片混勻，在5 min 內(nèi)觀察結(jié)果，發(fā)生凝集現(xiàn)象的即為陽(yáng)性，同時(shí)設(shè)生理鹽水和標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照[8-9]。用同樣方法，依次用A（O2）、B（O4）、C1（O7）、C2（O8）、D（O9）、E（O3）的O血清做玻片凝集試驗(yàn)，確定血清群。

2.5 分子生物學(xué)鑒定

2.5.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank中已發(fā)表的序列，參照文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)invA基因特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。

2.5.2 模板制備 挑取單個(gè)菌落置于50 μL離心管內(nèi)，加20 μL 雙蒸水混勻，95 ℃水浴10 min，-20 ℃靜置10 min，于 4 ℃ 12 000 r/min 離心2 min，取上清4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.3 PCR反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為50 μL：DNA模板 1 μL，10×PCR 緩沖液（含 MgCl2）5 μL，dNTP 2 μL，P1、P2 各 1 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，dd-H2O 39.5 μL。

表1 invA基因引物序列

2.5.4 PCR 反應(yīng)條件 94 ℃ 8 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。設(shè)不加DNA 模板的反應(yīng)體系溶液作為空白對(duì)照。

2.5.5 PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè) 配30 mL 1.5 %瓊脂糖于微波爐完全溶化，加入3 μL溴化乙錠混勻，待冷至80 ℃時(shí)倒板，完全凝固后拔出梳子，每孔加PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL，以溴酚藍(lán)作指示劑，于0.5×TBE中130 V電壓電泳30 min，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

將120只7日齡健康雛雞隨機(jī)分為20組，每組6只。其中：18組分別皮下接種菌液，每只接種菌液0.2 mL（3×109CUF/mL）；2組為對(duì)照組，一組接種沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株菌液（3×109CUF/mL），另一組接種生理鹽水。接種后，每隔1 h，觀察并記錄雞的臨床情況[11]。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌分離

對(duì)所采集的121份樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，共分離出109株細(xì)菌，其中符合沙門氏菌生長(zhǎng)特征的107株。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)所分離的細(xì)菌為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌，長(zhǎng)約1～5 μm，符合沙門氏菌特征（圖1）。

3.2 生化鑒定

對(duì)所分離出的107株可疑菌株進(jìn)行賴氨酸脫羧酶、靛基質(zhì)、尿素酶、氰化鉀、硫化氫、山梨醇、甘露醇、水楊苷、丙二酸鹽、衛(wèi)矛醇、ONPG及葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、阿拉伯糖試驗(yàn)，確定有104株符合沙門氏菌特征（圖2）。

圖1 雞源性沙門氏菌革蘭氏染色鏡檢形態(tài)（10×100）

3.3 血清型鑒定

對(duì)所分離的104株沙門氏菌進(jìn)行血清型分型鑒定，發(fā)現(xiàn)這104株菌共屬于4個(gè)血清群，其中A群（O2）13株、C1群（O7）29株、C2群（O8）9株、D群（O9）53株，優(yōu)勢(shì)血清群為D群（51%）和C1群（27%）。

3.4 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)所分離的沙門氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)所分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照均擴(kuò)增出invA基因片斷，大小為372 bp，表明所分離的沙門氏菌為致病性沙門氏菌?？瞻讓?duì)照組為陰性，無(wú)特異性條帶出現(xiàn)（圖3）。

3.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

雛雞接種所分離到的細(xì)菌6 h左右開始發(fā)病，表現(xiàn)精神沉郁，不食或少食，8 h后開始腹瀉，拉白色糞便，表明所分離的沙門氏菌具有致病性。接種后感染率達(dá)100%，生理鹽水對(duì)照組感染率為0。

4 討論

雞源沙門氏菌病是雞的常見(jiàn)傳染病之一[12]，分為雞白痢、雞傷寒和雞副傷寒[13]，嚴(yán)重影響種雞受精率、種蛋孵化率、雛雞成活率、飼料利用率和商品蛋的品質(zhì)[14]，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害極大[15]，而蛋品和雞肉質(zhì)的好壞也關(guān)系到消費(fèi)者健康。本研究在拉薩市養(yǎng)雞密集的城關(guān)區(qū)、曲水縣、達(dá)孜縣、墨竹工卡縣、堆龍德慶縣5個(gè)縣（區(qū)），選擇有代表性的12個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)疑似發(fā)病雞采樣，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和血清分型。

圖2 雞沙門氏菌生化鑒定結(jié)果

圖3 沙門氏菌PCR鑒定結(jié)果

所有菌株呈A-F血清群凝集試驗(yàn)陽(yáng)性，表明可能均為致病性沙門氏菌。目前拉薩市的優(yōu)勢(shì)血清群為D群（占51%），其次為C1群（占28%），另外還存在A群、C2群。動(dòng)物感染試驗(yàn)顯示，所分離的沙門氏菌能引起雛禽發(fā)病，也表明所分離的沙門氏菌為致病性沙門氏菌。沙門氏菌inv基因簇與沙門氏菌的致病性有關(guān)，決定了其通過(guò)腸粘膜侵入宿主上皮細(xì)胞的能力，其中invA是沙門氏菌的主要毒力因子，因此對(duì)invA基因的檢測(cè)是識(shí)別致病性沙門氏菌的有效方法。

近幾年來(lái)西藏旅游人數(shù)逐漸增多，導(dǎo)致高原畜禽產(chǎn)品需求增加，因而帶動(dòng)了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。但該地養(yǎng)雞場(chǎng)飼養(yǎng)管理技術(shù)較滯后，仍采用過(guò)去的飼養(yǎng)管理方法，多數(shù)雞舍環(huán)境衛(wèi)生狀況較差，通風(fēng)不良，沒(méi)有嚴(yán)格執(zhí)行定期消毒制度，致使沙門氏菌等大量微生物在雞舍環(huán)境中滋生，從而給當(dāng)?shù)氐那莓a(chǎn)品衛(wèi)生安全帶來(lái)威脅。因此，當(dāng)?shù)卣诖罅Πl(fā)展規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的同時(shí)，也要加大農(nóng)牧技術(shù)培訓(xùn)力度，推進(jìn)養(yǎng)殖設(shè)備、飼料、獸藥、消毒劑等供銷市場(chǎng)的建設(shè)。