李鎖 程險峰 李新宇 李志量 荊可 向睿宇 張寒梅 馮素英

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病醫(yī)院皮膚科 江蘇省皮膚病與性病學重點實驗室，南京 210042

對大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）患者行鹽裂皮膚間接免疫熒光檢查可發(fā)現(xiàn)免疫復(fù)合物沉積在表皮側(cè)，然而基底膜帶連接結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，表皮側(cè)抗原除BP180外，還有BP230、網(wǎng)蛋白及整合素等抗原，同時BP180胞外區(qū)含有多個自身抗體反應(yīng)的位點［1］，需要制備表皮側(cè)抗原分析患者自身抗體，以便對表皮下水皰病進一步分類及明確診斷。熱分離法和鹽裂法分離部位基本一致，位于透明層下部靠近致密層最薄弱處，但Meyer等［2-3］發(fā)現(xiàn)，采用熱分離法時BP180分子降解較少。我們利用熱分離法制備人表皮側(cè)抗原，探討表皮側(cè)蛋白制備過程，分析以表皮側(cè)蛋白為底物行Western印跡檢測診斷BP患者的敏感性和特異性，評估其在BP診斷中的價值。

對象與方法

一、臨床資料

收集2015年1月至2017年8月在中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院確診為BP住院患者和非BP住院患者（對照組）。

BP患者納入標準：①在皮膚紅斑基礎(chǔ)上出現(xiàn)緊張性水皰，尼氏征陰性；②組織病理表現(xiàn)為表皮下皰，伴/不伴真皮內(nèi)嗜酸性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤；③患者水皰周圍“正常”皮膚直接免疫熒光檢查可見基底膜帶IgG和/或C3線狀沉積；④鹽裂皮膚間接免疫熒光檢查表皮側(cè)可見IgG和/或C3線狀沉積；⑤行BP180 NC16A ELISA檢測示ELISA數(shù)值大于9 U/ml。符合④、⑤，或符合①、②、③+［④或⑤］可診斷BP［4-6］。

共入選BP患者22例，男16例，女6例，年齡43～84歲，平均年齡63.13歲，均在病情活動期抽取全血，其中21例BP180 NC16A ELISA為陽性。

對照組25例，男13例，女12例，年齡35～85歲，平均64.12歲，包括6例天皰瘡患者、4例多形紅斑、1例中毒性表皮壞死松解癥、1例紅皮病、1例白塞病、1例丘疹性蕁麻疹、11例濕疹，其中2例濕疹患者BP180 NC16A ELISA為陽性。BP組和對照組在年齡和性別等人口學特征上具有可比性（均P＞0.05）。

本研究經(jīng)中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準［批準號：（2016）快審第（KY004）號］，受試者均簽署知情同意書。

使用促凝管收集受試者外周靜脈血5 ml并靜置30 min，2 000 r/min（離心半徑15 cm）離心5 min，吸取上清液分入1 ml微量離心管中，并于-80℃冰箱保存。

二、正常皮膚組織標本獲取及表皮熱分離

自中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院和江蘇省常州市第二人民醫(yī)院收集20～30歲健康人包皮環(huán)切術(shù)后殘留的正常皮膚（取材前供者均簽署知情同意書）。熱分離法分離表皮：將裝有40 ml熱分離皮膚緩沖液的燒杯放入56℃水浴鍋中，并準備冰水，預(yù)冷PBS。正常皮膚組織去除皮下脂肪，用預(yù)冷的0.01 mol/L PBS沖洗干凈，并將皮片剪成2 cm×2 cm。將皮片放入56℃熱分離皮膚緩沖液（加入苯甲基磺酰氟）中4 min，置預(yù)冷的PBS中迅速冷卻。輕輕分離表皮和真皮，用濾紙將分離的表皮水分吸收后迅速放入液氮中。

三、正常皮膚表皮蛋白提取及變性

將研缽和研杵用液氮充分預(yù)冷，將正常皮膚放在研缽中，每次加15～20 ml液氮，用研杵研磨組織至粉末狀。將研磨后的組織粉末和熱分離表皮抗原提取液（樣本與提取液比例=250 g/L）放入置于冰水中的玻璃勻漿器。用勻漿管上下研磨20次（5 min左右），有效剪切DNA，直至提取液清澈。勻漿物在4℃下以13 000 r/min（離心半徑5 cm）離心30 min。取上清液，加入上樣緩沖液，置100℃水浴鍋中變性10 min，-80℃保存。

四、考馬斯亮藍凝膠染色檢測表皮側(cè)蛋白

具體方法參照《精編分子生物學實驗指南》［7］。

五、Western印跡檢測

Western印跡方法參照文獻［8］，對部分實驗條件進行調(diào)整，轉(zhuǎn)膜條件：恒流300 mA，120 min。封閉條件：5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉90 min。一抗反應(yīng)條件：患者血清濃度為1∶150，將膜放于雜交槽中，室溫下輕搖雜交70 min。二抗反應(yīng)條件：HRP標記的二抗?jié)舛葹?∶1 000，室溫孵育1 h。

六、BP180 NC16A ELISA

嚴格按照試劑盒說明書操作，使用酶標儀（BioTekSynergyht）在波長450 nm下讀取吸光度（A值），按照說明書的公式計算血清抗體滴度值。

七、統(tǒng)計學方法

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS22.0進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗法分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、考馬斯亮藍染色結(jié)果

表皮側(cè)蛋白經(jīng)考馬斯亮藍染色檢測，結(jié)果顯示，上樣量為5～10μl時條帶清晰，便于進行Western印跡檢測。表皮側(cè)蛋白相對分子質(zhì)量主要集中在40 000～60 000及15 000以下和240 000以上，見圖1。

圖1 熱分離制備的正常皮膚表皮側(cè)蛋白考馬斯亮藍染色分析圖M：蛋白分子標記物；1～5：上樣量分別為20、17.5、15、10、5μl

二、表皮側(cè)蛋白Western印跡與BP180 NC16A ELISA檢測結(jié)果比較

表皮側(cè)蛋白Western印跡、BP180 NC16A ELISA敏感性分別為86.36%（95%CI為64.03%～96.41%）、95.45%（95%CI為75.11%～99.76%）（χ2=1.10，P=0.294）；特異性分別為100%（95%CI為83.42%～100%）、92.00%（95%CI為75.11%～99.76%）（χ2=2.08，P=0.149）。見表1。

三、表皮側(cè)蛋白Western印跡條帶分析

22例BP患者表皮側(cè)蛋白Western印跡結(jié)果見圖2。4例可見相對分子質(zhì)量（relative molecule mass，RMM）為230 000的陽性條帶；18例為180 000的陽性條帶，BP180 ELISA結(jié)果均大于90 U/L；1例為120 000的陽性條帶，BP180 ELISA結(jié)果為53.3 U/L；1例為97 000且同時有180 000陽性條帶，BP180 ELISA結(jié)果為198 U/L。

對照組表皮側(cè)蛋白Western印跡檢測結(jié)果見圖3。6例天皰瘡患者中1例RMM為160 000的陽性條帶，2例為130 000陽性條帶，其余患者未出現(xiàn)陽性條帶。

討 論

本研究中，考馬斯亮藍染色檢測顯示熱分離法制備的表皮側(cè)蛋白RMM多集中在40 000～60 000、15 000以下和240 000以上，RMM為150 000～240 000之間的蛋白相對較少，說明基底膜帶表皮側(cè)蛋白豐度低，并且提取過程容易造成胞膜蛋白組成和結(jié)構(gòu)損傷，因此將基底膜帶表皮側(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)從復(fù)雜物質(zhì)體系中提取出來難度很大。表皮側(cè)蛋白提取過程中最重要的是避免蛋白降解，因此皮膚組織轉(zhuǎn)運過程中應(yīng)當做到以下3點：①實驗常規(guī)耗材及儀器嚴格消毒或滅菌；②低溫處理，且從包皮切取到實驗操作間隔不宜超過1 h；③將包皮組織裝入含有滅菌10%胎牛血清-DMEM溶液中。采用液氮研磨破碎組織，可以更好地保持目的蛋白的化學性質(zhì)，同時有效避免蛋白酶對目的蛋白的降解［9］。經(jīng)典的表皮抗原提取液主要成分為2% SDS，SDS去垢能力強，但溫和性不夠理想，因此操作過程中應(yīng)動作輕柔，避免氣泡產(chǎn)生，并需要剪切DNA以避免其影響蛋白提取。組織樣品過多會超過裂解液溶解的能力，反而會使導(dǎo)致目的蛋白提取不充分，因此我們推薦表皮側(cè)組織樣品與裂解液的比例為250 g/L。由于表皮側(cè)目的蛋白分子量較大，我們建議蛋白變性條件為100℃水浴10 min，必要時可在上樣前高速離心（13 000 r/min，離心半徑5 cm，5 min）。

表1 熱分離法制備的BP表皮側(cè)蛋白Western印跡和BP180 NC16A ELISA檢測結(jié)果 例

圖2 熱分離制備的22例大皰性類天皰瘡患者表皮側(cè)蛋白Western印跡結(jié)果M：蛋白分子標記物；1～22：患者序號

圖3 熱分離制備的25例非大皰性類天皰瘡患者表皮側(cè)蛋白Western印跡結(jié)果M：蛋白分子標記物；1～25：患者序號

目前表皮側(cè)蛋白Western印跡在皰病診斷中的可操作性及其特點仍然不是非常明確。BP180 NC16A ELISA試劑盒以BP180 NCl6A融合蛋白為包被抗原，并確定分界值為9 U/ml，這樣可避免因為重組蛋白來源和長度不同及分界值方法不同而引起的誤差，能夠為臨床提供客觀、重復(fù)性好的定量數(shù)據(jù)，為表皮側(cè)蛋白Western印跡結(jié)果比較提供了良好對照。我們發(fā)現(xiàn)，表皮側(cè)蛋白Western印跡、BP180 NC16A ELISA診斷BP的敏感性分別為86.36%、95.45%，而且，18例RMM為180 000條帶陽性的BP患者BP180 NC16A ELISA結(jié)果均大于90 U/L，1例RMM為120 000條帶陽性的BP患者BP180 NC16A ELISA值為53.3 U/L，3例表皮側(cè)蛋白Western印跡陰性的BP患者，其ELISA結(jié)果分別為0、13、48.2 U/ml，提示表皮側(cè)蛋白Western印跡實驗與BP180 NC16A ELISA相比敏感性并不是很高，當患者自身抗體滴度較低時其結(jié)果往往為陰性。表皮側(cè)蛋白Western印跡、BP180 NC16A ELISA特異性結(jié)果分別為100%、92%，實驗結(jié)果說明，表皮側(cè)蛋白Western印跡特異性高，該法為BP確診提供了一個可靠的診斷方法［10-11］。

目前已經(jīng)證實，BP180 NC16A的近膜端包含有BP的病理性抗原決定簇，是致病性自身抗體識別的主要靶表位［6］，表皮分離及蛋白提取方法逐漸調(diào)整為更加有效地提取細胞膜相關(guān)蛋白及避免其降解，這也是目前表皮側(cè)蛋白Western印跡方法檢測BP180較檢測BP230更加敏感的原因之一［12-13］。BP180有兩種可溶性胞外區(qū)結(jié)構(gòu)，其RMM分別為120 000和97 000，均包含NC16A表位，因此我們對BP患者行表皮側(cè)蛋白Western印跡檢測可發(fā)現(xiàn)RMM為120 000和97 000的蛋白條帶。

綜上，對BP患者行表皮側(cè)蛋白Western印跡檢測主要陽性條帶RMM為180 000。表皮側(cè)蛋白免疫印跡敏感性低于BP180 NC16A ELISA，當患者自身抗體滴度較低時表皮側(cè)蛋白Western印跡結(jié)果往往為陰性。熱分離法制備表皮側(cè)蛋白簡單、方便，以此為底物行Western印跡可進一步明確自身免疫性表皮下水皰病靶抗原，將來可以通過選擇新的底物（富含半橋粒的角質(zhì)形成細胞）、優(yōu)化表皮側(cè)蛋白制備過程，提純血清抗體等多種途徑，進一步提高表皮側(cè)蛋白Western印跡的敏感性。