胡佳 田晶晶

（蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)系 江蘇 蘇州 215000）

骨質(zhì)疏松癥是由于骨組織的代謝紊亂所導(dǎo)致的一種骨密度降低、骨骼礦化量降低，骨折風(fēng)險(xiǎn)增大的一種常見(jiàn)疾病[1]，逐漸成為威脅我國(guó)人民生存狀況的一大惡因[2]。地塞米松作為常用抗炎抗過(guò)敏藥物，會(huì)產(chǎn)生誘發(fā)骨質(zhì)疏松的不良反應(yīng)[3]，從而影響他的適用范圍。有研究表明斑馬魚(yú)幼魚(yú)具有完整的成骨與破骨體系，且其關(guān)鍵調(diào)控基因與人類(lèi)基因具有同源性[4]。相較于大鼠等模式生物，斑馬魚(yú)模型耗時(shí)短、實(shí)驗(yàn)成本及實(shí)驗(yàn)難度低、實(shí)驗(yàn)效率高、靈敏度高[5]，適合建立骨質(zhì)疏松模型并進(jìn)行藥物高通量篩選。本次實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證地塞米松對(duì)于骨質(zhì)疏松的誘發(fā)作用，同時(shí)為探究選擇新的骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，特選擇斑馬魚(yú)用作模式生物。建立不同濃度梯度的地塞米松藥物處理組與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組，觀察不同組別的骨質(zhì)疏松程度。

1.資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斑馬魚(yú)成魚(yú)（TubABC種系），28℃恒溫，循環(huán)水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 茜素紅S染料；多聚甲醛；地塞米松；高純水。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 ZEISS熒光倒置顯微鏡Axioobserver.A1；生化培養(yǎng)箱SPX-80；Image pro plus 6.0專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物的配置 稱(chēng)取稱(chēng)取地塞米松以DMSO配置成2000μmol/L的儲(chǔ)備液，再用培養(yǎng)基稀釋成1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L含0.5%DMSO溶液的培養(yǎng)基。

1.2.2 給藥方法 將3dpf的斑馬魚(yú)放入12孔板中培養(yǎng)，每孔5條斑馬魚(yú)，每孔加入2ml培養(yǎng)基[6]；自4dpf開(kāi)始使用含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)，將原培養(yǎng)基全部吸凈后每孔加入含藥培養(yǎng)基2ml，空白對(duì)照組加入純培養(yǎng)基、陰性對(duì)照組加入含0.5%DMSO的培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)組分別加入1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L含0.5%DMSO溶液的培養(yǎng)基[7]。每天進(jìn)行一次半換藥，至9dpf取樣。

1.2.3 茜素紅染色 取培養(yǎng)至9dpf的斑馬魚(yú)幼魚(yú)，麻醉致死后在4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定2h；洗凈后置于50%乙醇室溫靜置10min；洗凈后使用0.5%KOH配制的茜素紅染色液染色，4℃放置過(guò)夜；染色后使用雙氧水與KOH配置的漂白液漂白，后保存至甘油溶液中封片以待觀察[8]。

1.2.4 骨骼礦化量及骨密度分析 用熒光顯微鏡觀察斑馬魚(yú)頭部骨骼情況[9]，以同樣的光強(qiáng)度與曝光設(shè)置采集圖像并使用Image pro plus 6.0專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件分析染色面積與累計(jì)光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行表示，行t檢驗(yàn)，使用χ2檢驗(yàn)計(jì)數(shù)資料，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 斑馬魚(yú)骨密度情況對(duì)比

采用Image pro plus 6.0專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件觀察染色面積，空白對(duì)照組染色面積43463單位，陰性對(duì)照組染色面積43073單位，1μmol/L實(shí)驗(yàn)組染色面積41988單位，5μmol/L實(shí)驗(yàn)組染色面積29639單位，10μmol/L實(shí)驗(yàn)組染色面積26327單位，15μmol/L實(shí)驗(yàn)組染色面積23221單位，20μmol/L實(shí)驗(yàn)組染色面積20643單位。1μmol/L實(shí)驗(yàn)組累計(jì)光密度較陰性對(duì)照組減小不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；5μmol/L～20μmol/L的濃度梯度內(nèi)斑馬魚(yú)骨密度隨地塞米松濃度的增加而減小，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 斑馬魚(yú)骨礦化量情況對(duì)比

采用Image pro plus 6.0專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件計(jì)算累計(jì)光密度值（IOD），空白對(duì)照組累計(jì)光密度16223單位，陰性對(duì)照組累計(jì)光密度16170單位，1μmol/L實(shí)驗(yàn)組累計(jì)光密度15435單位，5μmol/L實(shí)驗(yàn)組累計(jì)光密度13227單位，10μmol/L實(shí)驗(yàn)組累計(jì)光密度11096單位，15μmol/L實(shí)驗(yàn)組累計(jì)光密度9267單位，20μmol/L實(shí)驗(yàn)組累計(jì)光密度7653單位。1μmol/L實(shí)驗(yàn)組累計(jì)光密度較陰性對(duì)照組明顯減小，5μmol/L～20μmol/L的濃度梯度內(nèi)斑馬魚(yú)骨礦化量隨地塞米松濃度的增加而明顯減小，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 斑馬魚(yú)染色面積及累計(jì)光密度值對(duì)比

3.討論

斑馬魚(yú)作為最新的模式動(dòng)物，其骨骼發(fā)育體系與人類(lèi)骨骼發(fā)育類(lèi)似，均由神經(jīng)嵴發(fā)育而來(lái)，具有完整的骨形成與骨吸收體系[10]。同時(shí)斑馬魚(yú)由于實(shí)驗(yàn)難度小、實(shí)驗(yàn)成本低、靈敏度高等原因，被廣泛用于高通量藥物篩選的模式動(dòng)物。有研究報(bào)道斑馬魚(yú)脊柱骨骼骨化機(jī)制相較于頭部骨骼骨化機(jī)制，與哺乳動(dòng)物差異較大[11]，故本次實(shí)驗(yàn)選取斑馬魚(yú)頭部骨骼進(jìn)行觀察。

有研究表明，地塞米松可用于誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的形成從而為抗骨質(zhì)疏松的藥物篩選提供模型[12]。本次實(shí)驗(yàn)使用不同濃度梯度的地塞米松處理斑馬魚(yú)幼魚(yú)，得到梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為地塞米松誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)的骨質(zhì)疏松模型切實(shí)可靠，克服了大鼠模型成本高、難度大、靈敏度低的不利因素，適宜用作建立骨質(zhì)疏松模型。

多次臨床實(shí)驗(yàn)表示地塞米松對(duì)患者骨骼發(fā)育會(huì)產(chǎn)生不良影響[13]，本次實(shí)驗(yàn)也證明了此觀點(diǎn)，為地塞米松的用藥提供了進(jìn)一步的臨床指導(dǎo)意義。而斑馬魚(yú)模型的建立有利于高效快速的抗骨質(zhì)疏松藥物篩選，期待臨床上骨質(zhì)疏松的治療效果可以得到進(jìn)一步的提升。