梅 麗，栗鳳娟，楊 樺

（江蘇萬邦醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 徐州 221004）

胰島素是治療糖尿病的有效藥物[1]，但普通胰島素因存在作用時(shí)間短、吸收變異大、作用峰值明顯、低血糖發(fā)生率高等諸多問題，日益被胰島素類似物取代[2]。門冬胰島素臨床用于治療糖尿病[3]，于2000年在美國批準(zhǔn)上市[4]，其與常規(guī)胰島素相比可更快地控制血糖，對1型與2型糖尿病有良好的療效，市場前景廣闊[5-6]。與傳統(tǒng)的高效液相色譜（HPLC）法相比，超高效液相色譜（UPLC）法填料顆粒小、均勻，具有柱效高、分析速度快、分離度高、靈敏度好等特點(diǎn)[7-8]，因此被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物研究分析等領(lǐng)域[9]。本研究中采用UPLC法測定門冬胰島素的含量，為提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器：LC-30A型高效液相色譜儀，包括SPD檢測器（日本 Shimadzu公司）；FE20型酸度計(jì)、XS105型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

試藥：門冬胰島素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為 410011-201501，效價(jià)為 27.5 U／mg）；門冬胰島素（江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司，批號為E0301）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GISS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：0.2 mol／L Na2SO4溶液(取無水硫酸鈉 28 g，加水 900 mL溶解，加 85%磷酸溶液 2.7 mL，用乙醇胺調(diào) pH 至 3.6，加水至 1 000 mL，經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜濾過，即得)-乙腈（72 ∶18，V／V，A）-50%乙腈(B)，梯度洗脫（0～10 min，65%A；10～23 min，65%A→20%A；23～25 min，20%A→65%A；25～30 min，65%A）；流速：0.25 mL／min；檢測波長：214 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液制備

取門冬胰島素對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加0.01 mol／L鹽酸溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1.0 g／L的溶液，室溫放置，使B3Asp門冬胰島素和A21Asp門冬胰島素的含量不低于1%，作為系統(tǒng)適用性溶液。取門冬胰島素對照品10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用0.01 mol／L鹽酸溶解并定容，制成每1 mL含 1.0 mg（約 10 U）的對照品溶液。取樣品約 10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用0.01 mol／L鹽酸溶解并定容，搖勻，即得供試品溶液。以0.01 mol／L鹽酸溶液作為陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果陰性對照品溶液色譜在與對照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明專屬性良好。

圖1 超高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取門冬胰島素對照品50.05 mg，置25 mL容量瓶中，用0.01 mol／L鹽酸溶液制成質(zhì)量濃度分別為 0.7，0.9，1.0，1.1，1.3 g／L 的系列對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以門冬胰島素質(zhì)量濃度（X，g／L）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝ -10 468X＋36 966，R2＝0.999 99（n＝5）。結(jié)果表明，門冬胰島素質(zhì)量濃度在 0.05～1.30 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取對照品溶液適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，平行 6次，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.02%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液適量，定容，室溫放置，分別于 0，2，4，6，8，10，12，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.18%（n＝8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品6份，同法制成供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.02%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別量取低、中、高質(zhì)量濃度的門冬胰島素對照品溶液各適量，共9份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

3 討論

本研究中建立了檢測門冬胰島素含量的UPLC法。該法的出峰時(shí)間僅為8 min，與高效液相色譜法所需的出峰時(shí)間22 min相比，時(shí)間縮短了64%，能更快速檢測門冬胰島素含量，且方法專屬性好，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于測定門冬胰島素含量。