郭偉峰，王紅梅，鄒曉桐，羅秀秀，王萍，曾霞，尹愛國，周英彪，*

（1.廣東石油化工學院廣東省嶺南特色果蔬加工及應用工程技術研究中心，廣東普通高校食品科學創(chuàng)新團隊，廣東茂名525000；2.廣東石油化工學院生物與食品工程學院，廣東茂名525000）

桑葚（Fru ctus mori）又叫桑果、桑椹、桑椹子、桑葚子，是桑樹所結的果實，味甘性寒，歸心、肝、腎經，具有滋陰補血、生津止渴、補肝益腎等功效[1]。桑葚果汁色澤艷麗，且富含維生素、胡蘿卜素、黃酮醇、花青素、酚酸等多種生物活性物質，具有良好的保健功能[2]。目前對桑葚的加工形式有干果[3]、果汁[4]、復合飲料[5]、果酒[6-8]及果醋[9-11]等。

酵素按用途可分為食用酵素、環(huán)保酵素、日化酵素及飼用酵素。其中，食用酵素是指以動物、植物及菌類為原料，經微生物發(fā)酵而制得具有特定生物活性成分可食用的產品[12]。其中生物活性成分對生物現(xiàn)象有影響的微量或少量物質，包括多糖類、寡糖類、蛋白質、酶及多肽類、氨基酸類、維生素類、及醇、酯、酸、酚類等[13]。進行桑葚酵素的研究開發(fā)，可以豐富桑葚的深加工形成，滿足市場需求。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是重要的生物活性因子，在保護細胞免受氧自由基的毒害中發(fā)揮著重要作用，在醫(yī)藥、食品工業(yè)及農業(yè)上均有廣泛的應用前景[14-16]。SOD酶活力是優(yōu)化酵素發(fā)酵工藝的常用指標之一，此類的研究報道較多。如利用SOD酶活力作為指標，劉鑫等優(yōu)化了藍莓酵素發(fā)酵工藝[17]，馮彥君等優(yōu)化了藍莓酵素發(fā)酵工藝[18]，韋仕靜等優(yōu)化了西蘭花酵素發(fā)酵工藝[19]。

近年來，對桑葚酵素的研究開發(fā)也有報道。如Kwaw E等[20]以總酚為指標，優(yōu)化了利用乳酸桿菌發(fā)酵桑葚果汁制備桑葚酵素飲料的工藝；韋仕靜等[21]以桑葚干果粉混合蘋果汁為原料，乳酸桿菌為發(fā)酵菌株，總酸與總糖為指標，優(yōu)化了桑葚酵素的發(fā)酵工藝。本研究以桑葚果汁為原料，SOD酶活力為指標，先從釀酒酵母、醋酸桿菌及植物乳酸桿3種種屬中優(yōu)選出合適菌種組合，然后單因素及正交試驗優(yōu)化了桑葚酵素飲料的發(fā)酵工藝，并對優(yōu)化發(fā)酵工藝下制得的桑葚酵素飲料做了質量評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料、菌株與培養(yǎng)基

1.1.1.1 原料

桑葚（Fructusmori），產自廣東省化州市。

1.1.1.2 菌株

釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae，CGMCC2.3853）：中國普通微生物菌種保藏管理中心，醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus，CICC 20064） 及植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum，CICC 21790）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，酵母粉 10 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

1.2 主要試劑與儀器設備

1.2.1 主要試劑

鄰苯三酚：國藥集團；其他試劑分析純。

1.2.2 主要儀器

WJS1222F型榨汁機：廣東美的電器股份有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；DHZ-DA型臥式恒溫搖床：蘇州培英實驗設備有限公司；YP10002型電子天平：上海佑科上海佑科儀器儀表有限公司；Gene 1580R型臺式高速冷凍離心機（Gene Company Limited），及L5S型紫外可見分光光度計：上海儀電科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚酵素飲料的工藝流程

桑葚酵素飲料的工藝流程如圖1所示。

圖1 桑葚酵素飲料的工藝流程Fig.1 The process of the mulberry ferment beverage

包括桑葚分選、桑葚榨汁、桑葚果汁調配、菌種培養(yǎng)與洗滌、桑葚果汁純菌體接種、發(fā)酵、發(fā)酵液靜置2 h澄清、8 000 r/min 離心 10 min、0.45 μm 濾膜過濾、質量檢測、分裝等工序。

1.3.2 原料的預處理

將-20℃冰箱保藏的桑葚轉移到4℃冰箱中24 h，使結冰完全融化，于榨汁機中榨汁，純桑葚榨汁不加水，榨汁后加入終濃度0.2 g/L偏重亞硫酸鉀防氧化。桑葚果汁裝瓶封口，-20℃冰箱保存，試驗前在4℃冰箱中解凍24 h。

1.3.3 菌株培養(yǎng)與洗滌

釀酒酵母（YPD培養(yǎng)基，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)）、醋酸桿菌（LB培養(yǎng)基，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)）與植物乳酸桿菌（LB培養(yǎng)基，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)）培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期，分別按接種量取培養(yǎng)液，離心去除培養(yǎng)基，無菌水洗滌菌體2次后，菌體接入桑葚果汁進行發(fā)酵。

1.3.4 SOD酶活力測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定桑葚果汁及桑葚酵素樣品的SOD酶活力[22-23]。

鄰苯三酚的自氧化速率測定：在試管中加入4.00mL蒸餾水、4.50 mL PBS（phosphate buffer saline）緩沖液（pH 8.3、50 mmol/L）、1.00 mL EDTA（ethylene diamine tetraacetic acid）溶液（10 mmol/L），混勻，25 ℃平衡20 min；然后加入0.50 mL鄰苯三酚溶液（3 mmol/L、25℃預熱），迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在325 nm波長處測定光吸收值，每隔30 s讀數(shù)一次，測定4 min內每分鐘光吸收值的變化速率?？瞻讓φ諡?.00 mL蒸餾水、4.50 mL PBS緩沖液（pH 8.3、50 mmol/L）、1.00 mL EDTA溶液（10 mmol/L）混合0.50 mL HCl（10 mmol/L）。

樣品光密度值變化速率測定：桑葚果汁及桑葚酵素樣品8 000 r/min、離心10 min，取上清液稀釋10倍。在試管中加入0.20 mL稀釋后的樣品、3.80 mL蒸餾水、4.50 mL PBS 緩沖液（pH 8.3、50 mmol/L）、1.00 mL EDTA 溶液（10 mmol/L），混勻，25℃平衡 20 min；然后加入0.50 mL鄰苯三酚溶液（3 mmol/L、25℃預熱），迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在325 nm波長處測定光吸收值，每隔30 s讀數(shù)一次，測定4 min內每分鐘光吸收值的變化速率?？瞻讓φ胀啊?/p>

式中：V1為反應液總體積，mL；V2為測定樣品體積，mL；n為樣品稀釋液倍數(shù)；ODA為鄰苯三酚的自氧化速率；ODB為樣品光密度值變化速率。

1.3.5 確定最佳發(fā)酵菌種

設置7個菌種組合：植物乳酸桿菌、醋酸桿菌、釀酒酵母、植物乳酸桿菌+釀酒酵母、植物乳酸桿菌+醋酸桿菌、醋酸桿菌+釀酒酵母、植物乳酸桿菌+醋酸桿菌+釀酒酵母；菌株組合體積比例為1∶1和1∶1∶1。桑葚果汁量為120 mL，調初始糖度為6 Brix，接種量為5%（菌種活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體），發(fā)酵溫度設置為30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間設置為48 h。取樣測定各個菌株組合發(fā)酵液的單位SOD酶活力（每組測3個平行樣），比較其顯著性，選單位SOD酶活力最高的菌種組合進行進一步探究。

1.3.6 單因素試驗

選取確定最佳發(fā)酵菌種試驗中發(fā)酵液單位SOD酶活力最高的菌種組合作為桑葚酵素的發(fā)酵菌種，進行發(fā)酵溫度、接種量、初始糖度及發(fā)酵時間等單因素試驗，以單位SOD酶活力為指標，研究各因素對桑葚酵素發(fā)酵的影響。

1.3.6.1 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度設置為 26、28、30、32、34、36 ℃共 6 個水平。桑葚果汁量為120 mL，初始糖度為6 Brix，接種量為10%（菌種活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體），180 r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間設置為24 h。取樣測定各個水平發(fā)酵液的單位SOD酶活力（每水平測3個平行樣），t-檢驗比較其顯著性。

1.3.6.2 接種量

接種量設置5%、10%、15%、20%、25%、30%共6個水平（菌種活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體）。桑葚果汁量為120 mL，初始糖度為6 Brix，發(fā)酵溫度選取發(fā)酵溫度因素試驗中的最優(yōu)發(fā)酵溫度，180 r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間設置為24 h。取樣測定各個水平發(fā)酵液的單位SOD酶活力（每水平測3個平行樣），比較其顯著性。

1.3.6.3 初始糖度

用白砂糖調節(jié)桑葚果汁初始糖度為6、10、14、18、22、26 Brix共6個水平。桑葚果汁量為120 mL，接種量設置為接種量因素試驗中的最優(yōu)接種量（菌種活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體），發(fā)酵溫度選取發(fā)酵溫度因素試驗中的最優(yōu)發(fā)酵溫度，180 r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間設置為24 h。取樣測定各個水平發(fā)酵液的單位SOD酶活力（每水平測3個平行樣），t-檢驗比較其顯著性。

1.3.6.4 發(fā)酵時間

發(fā)酵時間設置為 8、16、24、32、40、48 h 共 6 個水平。桑葚果汁量為120 mL，初始糖度為初始糖度因素試驗中的最優(yōu)初始糖度，接種量設置為接種量因素試驗中的最優(yōu)接種量（菌種活化培養(yǎng)與洗滌后接入菌體），發(fā)酵溫度選取發(fā)酵溫度因素試驗中的最優(yōu)發(fā)酵溫度，180 r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間設置為24 h。取樣測定各個水平發(fā)酵液的單位SOD酶活力（每水平測3個平行樣），t-檢驗比較其顯著性。

1.3.7 正交試驗

依據單因素試驗結果，選取發(fā)酵溫度、接種量、初始糖度及發(fā)酵時間4個因素各3個顯著水平，進行四因素三水平L9（34）正交試驗，以桑葚酵素中單位SOD酶活力為指標，確定最優(yōu)桑葚酵素發(fā)酵工藝。

1.3.8 質量評價

采用優(yōu)化所得的發(fā)酵條件，按桑葚酵素飲料的工藝流程制備葚酵素飲料，參照GB/T 10789-2015《飲料通則》[24]、GB/T 31121-2014《果蔬汁類及其飲料》[25]、及GB/T 30884-2014《蘋果醋飲料》[26]等相關標準，對桑葚酵素飲料的感官、理化及微生物指標進行評價。

1.3.9 數(shù)據處理

試驗數(shù)據用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行處理與分析，組間差異比較采用t-檢驗方法。

2 結果與分析

2.1 確定最佳發(fā)酵菌種

7個菌種組合發(fā)酵所得桑葚酵素，均沒有異味，風味上均可以接受。菌種對桑葚酵素發(fā)酵的影響見圖2。

圖2 菌種對桑葚酵素發(fā)酵的影響Fig.2 Effect on mulberry ferment with fermentation strain

由圖2可知，與單位SOD酶活力最低的（釀酒酵母）比較，植物乳酸桿菌、醋酸桿菌、植物乳酸桿+菌醋酸桿菌為發(fā)酵菌種的差異極為顯著（p＜0.01），植物乳酸桿菌+釀酒酵母、醋酸桿菌+釀酒酵母、植物乳酸桿菌+釀酒酵母+醋酸桿菌為發(fā)酵菌種的差異顯著（p＜0.05），說明發(fā)酵菌種對桑葚酵素的發(fā)酵有明顯影響。其中，以醋酸桿菌為發(fā)酵菌種的桑葚酵素單位SOD酶活力（19 146.2 U/mL）最高，因此選取醋酸桿菌為發(fā)酵菌種，進行后續(xù)研究。

2.2 單因素試驗

2.2.1 發(fā)酵溫度

酵溫度對桑葚酵素發(fā)酵的影響見圖3。

由圖3可知，在初始糖度為6 Brix、發(fā)酵菌種為醋酸桿菌、接種量為10%、發(fā)酵時間24 h情況下，發(fā)酵溫度對桑葚酵素的單位SOD酶活力有明顯影響；隨著發(fā)酵溫度的升高桑葚酵素的單位酶活力逐漸升高，當溫度達到30℃時單位酶活力達到最高，當溫度超過30℃時，單位酶活力明顯下降。因此選取28、30、32℃此3個發(fā)酵溫度水平進行正交試驗。

圖3 發(fā)酵溫度對桑葚酵素發(fā)酵的影響Fig.3 Effect on mulberry ferment with ermentation temperature

2.2.2 接種量

接種量對桑葚酵素發(fā)酵的影響見圖4。

圖4 接種量對桑葚酵素發(fā)酵的影響Fig.4 Effect on mulberry ferment with inoculum

由圖4可知，在初始糖度為6 Brix、發(fā)酵菌種為醋酸桿菌、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時間24 h情況下，接種量對桑葚酵素的單位SOD酶活力有明顯影響；接種量為5%時桑葚酵素的單位酶活力較低，隨著菌種接種量的提高單位酶活力逐漸升高，當接種量達到10%時單位酶活力達到最高，接種量超過10%單位酶活力開始明顯下降。因此選取5%、10%、15%此3個接種量水平進行正交試驗。

2.2.3 初始糖度

初始糖度對桑葚酵素發(fā)酵的影響見圖5。

由圖5可知，在發(fā)酵菌種為醋酸桿菌、接種量為10%、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時間24 h情況下，初始糖度對桑葚酵素的單位SOD酶活力有明顯影響；初始糖度為6Brix時，桑葚酵素的單位酶活力較低，隨著初始糖度的提高單位酶活力逐漸升高，初始糖度達到14 Brix時桑葚酵素的單位酶活力達到最高，超過14 Brix后，單位酶活力開始逐漸下降。因此選取10 Brix、14 Brix、18 Brix此3個初始糖度水平進行正交試驗。

圖5 初始糖度對桑葚酵素發(fā)酵的影響Fig.5 Effect on mulberry ferment with initial sugar content

2.2.4 發(fā)酵時間

發(fā)酵時間對桑葚酵素發(fā)酵的影響見圖6。

圖6 發(fā)酵時間對桑葚酵素發(fā)酵的影響Fig.6 Effect on mulberry ferment with fermentation time

由圖6可知，在發(fā)酵菌種為醋酸桿菌、初始糖度為6 Brix、接種量為10%、發(fā)酵溫度為30℃情況下，初始糖度對桑葚酵素的單位SOD酶活力有明顯影響；桑葚酵素的單位SOD酶活力隨發(fā)酵時間的延長，呈先升高后降低的趨勢，發(fā)酵時間為24 h時，桑葚酵素的單位SOD酶活力達最高。因此選取16、24、32 h此3個發(fā)酵時間水平進行正交試驗。

2.3 正交試驗

依單因素試驗結果，選取A發(fā)酵溫度（28、30、32℃）、B 發(fā)酵時間（16、24、32 h）、C 初始糖度（10、14、18 Brix）及D接種量（5%、10%、15%）進行L9（34）正交試驗。結果如表1所示。

表1 桑葚酵素發(fā)酵L9（34）正交試驗結果Table 1 Orthogonal experiment results of fermentation for mulberry ferment L9（34）

續(xù)表1 桑葚酵素發(fā)酵L9（34）正交試驗結果Continue table 1 Orthogonal experiment results of fermentation for mulberry ferment L9（34）

桑葚酵素發(fā)酵的A發(fā)酵溫度、B發(fā)酵時間、C初始糖度及D醋酸菌接種量4個因素的極差（R）表現(xiàn)為：RA（1587.3）＞RC（673.4）＞RD（423.9）＞RB（336.7），因此影響桑葚酵素發(fā)酵的主次影響因素依次為發(fā)酵溫度、初始糖度、醋酸菌接種量、發(fā)酵時間。

k1、k2、k3分別為各因素各水平所對應的單位SOD酶活力的平均值，由表2可知，在 A 因素中，k2＞k3＞k1；在 B 因素中，k2＞k1＞k3；在 C 因素中，k2＞k3＞k1；在 D 因素中，k2＞k3＞k1。因此，各因素水平對結果影響的強弱順序是：A2＞A3＞A1，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D3＞D1；由此可得出荔枝酵素發(fā)酵工藝的最優(yōu)方案為A2B2C2D2。

綜合分析，最終確定桑葚酵素發(fā)酵工藝為：發(fā)酵溫度為30℃、初始糖度14 Brix、醋酸菌接種量為10%、發(fā)酵時間為24 h。在此工藝條件下，3次重復驗證試驗結果為，桑葚酵素的SOD酶活力為24 122.2 U/mL，大于正交試驗中的最大值23 088 U/mL。

2.4 桑葚酵素飲料的質量評價

2.4.1 桑葚酵素飲料的感官指標

桑葚酵素飲料感官指標的評價結果見表2。

表2 桑葚酵素飲料的感官評價表Table 2 Sensory evaluation of the mulberry ferment beverage

結果表明，以桑葚為原料采用最佳發(fā)酵工藝釀制的桑葚酵素飲料色澤紫紅鮮艷，酸味柔和，口感上佳，體態(tài)透明清澈無沉淀，具有桑葚果香和醋香。該桑葚酵素飲料感官指標符合及GB/T 30884-2014《蘋果醋飲料》[26]等相關標準。

2.4.2 桑葚果汁與桑葚酵素飲料理化成分指標比較

對桑葚酵素飲料中SOD酶活、總酸、總糖、還原糖進行測定，得到桑葚酵素飲料的理化指標，結果見表3。

表3 桑葚果汁與桑葚酵素飲料的理化指標Table 3 Physicochemical indexes of the mulberry juice and the mulberry ferment beverage

桑葚酵素飲料的SOD酶活力為24 122.2 U/mL，比較于桑葚果汁的SOD酶活力（10 818.7 U/mL）提高了123%；總酸為（3.82±0.08）g/L，總糖為（5.37±0.08）%，還原糖為（2.154±0.016）%，符合 GB/T 30884-2014《蘋果醋飲料》[26]等相關標準。

2.4.3 桑葚酵素飲料的微生物指標

桑葚酵素飲料微生物指標的評價結果見表4。

表4 桑葚酵素飲料的微生物指標Table 4 Microbial indicators of the mulberry ferment beverage

表4表明桑葚酵素飲料微生物指標符合GB/T 31121-2014《果蔬汁類及其飲料》[25]及GB/T 30884-2014《蘋果醋飲料》[26]等相關標準。

3 結論

本研究以桑葚果汁為原料，SOD酶活力為指標，先從釀酒酵母、醋酸桿菌及植物乳酸桿3種種屬中優(yōu)選出合適菌種組合，然后單因素及正交試驗優(yōu)化了桑葚酵素飲料的發(fā)酵工藝。

優(yōu)化后的桑葚酵素飲料的發(fā)酵工藝為：發(fā)酵菌種為醋酸菌，初始糖度14 Brix，接種量10%，發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間24 h；此工藝條件下制備的桑葚酵素飲料的SOD酶活力達24 122.2 U/mL，比桑葚果汁的SOD酶活力（10 818.7 U/mL）提高了123%；桑葚酵素飲料色澤紫紅鮮艷，酸味柔和，口感上佳，體態(tài)透明清澈無沉淀，具有桑葚果香和醋香，其感官指標、理化指標及微生物指標符合相關國家標準。