付明剛，郭麗英

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外科，新疆 烏魯木齊 830011）

MicroRNAs作為一類非編碼因子參與人類許多基因的生理過程[1]，近年來其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)影響腫瘤的侵襲性成為目前醫(yī)學(xué)研究的熱點之一，很多研究發(fā)現(xiàn)microRNAs在實體腫瘤的侵襲性上扮演著關(guān)鍵角色[2-3]。眾所周知，乳腺癌嚴(yán)重危害當(dāng)今社會婦女的身心健康，且發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，研究顯示許多microRNAs與乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展有著緊密聯(lián)系[4-5]。本研究在microRNAs固定組織穩(wěn)定并可定量提取的基礎(chǔ)上[6]，通過原位雜交技術(shù)檢測185例浸潤性導(dǎo)管癌石蠟組織中microRNA-146a（miR-146a）的表達(dá)，分析miR-146a在乳腺癌組織中的表達(dá)與不同臨床分子亞型組間的差異及預(yù)后的關(guān)聯(lián)，探討其是否能成為預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月—2016年8月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院185例女性乳腺癌患者石蠟組織標(biāo)本，均經(jīng)病理明確診斷為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌。入組患者均經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，納入標(biāo)準(zhǔn)：①未接受術(shù)前新輔助化療及新輔助內(nèi)分泌治療，具有完整的臨床資料。②入組患者年齡28～72歲，中位年齡46歲。③所有患者均行乳腺癌改良根治術(shù)，術(shù)后接受表阿霉素+多西他賽（TA）3周方案6周期常規(guī)化療（表阿霉素成人常用量為每療程按體表面積60 mg/m2，多西他賽為75 mg/m2）。④所有石蠟標(biāo)本組織切片厚約4 μm。

1.2 材料與試劑

miR-146a探針購自丹麥Exiqon公司，敏感型原位雜交試劑盒（MK1030）購自武漢博士德生物有限公司，DAB顯色試劑盒及其他常規(guī)試劑購自新疆烏魯木齊寶信生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原位雜交技術(shù)檢測乳腺癌石蠟組織中miR-146a的表達(dá) 切片用脫蠟液梯度脫蠟，3%雙氧水室溫下處理切片10 min，蒸餾水洗2遍；室溫下胃蛋白酶覆蓋消化15 min，聚丁二酸丁二醇酯浸泡沖洗15 min；預(yù)雜交液37℃預(yù)雜交3 h；添加稀釋濃度為40 μg/ml的miR-146a探針，原位雜交蓋玻片覆蓋后恒溫箱37℃雜交過夜（約16 h）；2×檸檬酸鈉緩沖液梯度充分洗滌；封閉液37℃封閉60 min；室溫下滴加鼠抗地高辛玻片覆蓋后孵育2 h，聚丁二酸丁二醇酯浸泡沖洗15 min；滴加鏈霉親和素-生物素酶復(fù)合物37℃孵育20 min，聚丁二酸丁二醇酯洗3次，5 min/次；滴加生物素化過氧化物酶37℃孵育20 min，聚丁二酸丁二醇酯洗4次，5 min/次；二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，充分水洗，聚丁二酸丁二醇酯返藍(lán)，常規(guī)酒精梯度給予脫水，經(jīng)二甲苯透明后樹膠封片。以上各項檢測均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.2 原位雜交及免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷 原位雜交實驗結(jié)果為本院病理科高年資的病理醫(yī)師進(jìn)行結(jié)果評定。通過Olympus顯微鏡下觀察評分并記錄，miR-146a陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)為：每張切片在鏡下觀察5個不同的高倍視野（×200），通過觀察陽性染色的細(xì)胞強(qiáng)度及范圍，記錄并分析陽性標(biāo)志物的強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)后綜合計量[7]。免疫染色強(qiáng)度分級計分為3個等級，1分：無染色或弱染色（淡黃色顆粒）；2分：一般強(qiáng)度染色（顆粒狀棕黃色）；3分：強(qiáng)染色（顆粒狀或團(tuán)塊狀的棕褐色）；陽性細(xì)胞密度分級計分：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%評為1分；陽性細(xì)胞數(shù)10%～50%評為2分；陽性細(xì)胞數(shù)＞50%者評為3分。每例標(biāo)本最后得分綜合染色強(qiáng)度和分布范圍進(jìn)行半定量分析，染色強(qiáng)度與積分之積為實際評分，0分為陰性（-），1分為弱陽性（+），2 ～ 3 分為陽性（++），＞3 分為強(qiáng)陽性（+++）[8]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用Pearson χ2檢驗，乳腺癌分子亞型的分組兩兩比較采用Nemenyi秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-146a在乳腺癌組織中的表達(dá)

經(jīng)原位雜交技術(shù)檢測，結(jié)果顯示miR-146a在細(xì)胞胞漿中表達(dá)，陽性表達(dá)產(chǎn)物呈顆粒狀或團(tuán)塊狀在鏡下分布，依據(jù)表達(dá)強(qiáng)弱呈黃色分布、棕黃色或棕褐色分布。見附圖。

附圖 miR-146a在乳腺癌組織中的表達(dá) （×200）

2.2 miR-146a在乳腺癌4種不同臨床分子亞型中的表達(dá)

miR-146a在185例乳腺癌組織中51例表達(dá)（-），134例表達(dá)（+）。在Lumina A型中，miR-146a的陽性表達(dá)率最高，為84.0%，而在Basal-like型中miR-146a陰性表達(dá)率最高，為59.1%。經(jīng)Pearson χ2檢驗分析，4種分子亞型組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明不同分子亞型中miR-146a表達(dá)率不全相同（見表1）。經(jīng)Nemenyi秩和檢驗，Luminal A型相對Basal-like型陽性表達(dá)高（P＜0.05）（見表2）。

表1 miR-146a表達(dá)與乳腺癌分子亞型的關(guān)系 例（%）

表2 miR-146a表達(dá)與乳腺癌分子亞型的分組比較

3 討論

乳腺癌的發(fā)病率在我國呈逐漸增高的趨勢，隨著對乳腺癌研究的不斷深入，通過研究乳腺癌基因來分析乳腺癌生物學(xué)行為及預(yù)后成為一個重要的研究方向[9]。研究顯示，microRNAs作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因不僅在人類的多種實體腫瘤中起著關(guān)鍵作用，并且microRNAs的上調(diào)或者下調(diào)直接影響腫瘤的侵襲性，目前科學(xué)研究推測多種microRNAs為癌基因或抑癌基因參與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]，其通過影響靶基因從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控對應(yīng)的基因，作為重要的調(diào)節(jié)因子參與并調(diào)控相應(yīng)的信號通路[11-12]。目前證實人類的miR-146a位于第5號染色體LOC285628基因上[13]，其不僅參與正常組織的各種生理活動，而且在多種實體腫瘤發(fā)生、進(jìn)展階段miR-146a的表達(dá)會發(fā)生上調(diào)或者下調(diào)[14-15]。因此，隨著研究的深入，miR-146a在乳腺癌的預(yù)后判斷上已成為一個重要的研究方向。

2000年，PEROU等[16]定義乳腺癌4種臨床分子亞型，其分別為：Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型及Basal-like型。近年來，根據(jù)臨床分子亞型的不同，選擇不同的治療方案在乳腺腫瘤學(xué)的治療上成為一個里程碑式的革新?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實，即使相同的組織學(xué)分級和同等的病理分期，不同的臨床分子亞型的患者的腫瘤侵襲性及預(yù)后也有明顯的差異。因不同的臨床分子亞型的乳腺癌患者有著差異性的預(yù)后結(jié)果，國內(nèi)的乳腺癌診療指南已明確建議根據(jù)不同分子亞型的乳腺癌患者可采取相應(yīng)的個體化治療方案。

原位雜交技術(shù)通過帶有標(biāo)志物的核酸探針來檢測對應(yīng)的組織中待測核酸的表達(dá)，是對miRNAs表達(dá)的半定量分析方法之一。本研究通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在185例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者中，分子分型為Lumina A型中miR-146a的陽性表達(dá)率最高，而Basal-like型中miR-146a的陰性表達(dá)率最高，miR-146a在4種分子亞型組表達(dá)組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)Nemenyi秩和進(jìn)一步檢驗，Luminal A型相對于Basal-like型陽性表達(dá)高。眾所周知，Lumina A型乳腺癌患者的預(yù)后在4種分子亞型中的預(yù)后通常最好，在本研究中發(fā)現(xiàn)Lumina A型乳腺癌組織中miR-146a陽性表達(dá)率最高，據(jù)此推測miR-146a的陽性表達(dá)預(yù)示預(yù)后更好；而在Basal-like型中，miR-146a的陰性表達(dá)率最高，而Basal-like型為乳腺癌分子亞型中最具侵襲性的亞型，以往研究表明乳腺癌腫瘤組織中生物標(biāo)志物具有預(yù)后指導(dǎo)意義，而miR-146a在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中表達(dá)與患者分子分型相關(guān)，miR-146a陽性表達(dá)預(yù)示患者有著較好的預(yù)后。

綜上所述，通過185例浸潤性乳腺導(dǎo)管癌患者的原位雜交實驗提示不同分子亞型的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中miR-146a表達(dá)率不全相同，其中miR-146a表達(dá)在Basal-like型與Lumina A型中的表達(dá)有差異，提示miR-146a的低表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的侵襲性相關(guān)，本研究提示miR-146a有望成為乳腺癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。由于原位雜交技術(shù)為一種半定量檢測，其預(yù)測價值有限，仍有待一種定量的實驗進(jìn)一步證實。