王力，何揚(yáng) ，趙東波，陳樹梅，袁琳 ，王曉迪

（1.珠海市人民醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科，廣東 珠海 519000；2.杭州師范大學(xué)健康管理系，浙江 杭州 311121）

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）在體內(nèi)含量廣泛，屬于ErbB受體家族[1]，是一種位于細(xì)胞膜的跨膜受體蛋白，它與配體表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor, EGF）結(jié)合后，啟動(dòng)體內(nèi)一系列信號(hào)傳遞，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖與分化，是一種受體酪氨酸激酶[2-4]。糖尿病可引發(fā)多種并發(fā)癥，皮膚病是一種常見并發(fā)癥。糖尿病患者皮膚具有易感性，皮膚組織在無(wú)外源性創(chuàng)傷的情況下，其細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)等就已經(jīng)發(fā)生改變，這種“隱形損害”可導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面形成甚至長(zhǎng)期不愈。皮膚穩(wěn)態(tài)失衡和形態(tài)結(jié)構(gòu)變化可導(dǎo)致病變，例如皮膚發(fā)黃干燥。EGFR在糖尿病患者體內(nèi)許多組織中數(shù)量、性質(zhì)及表達(dá)發(fā)生改變[5-6]。有研究認(rèn)為[7-8]，糖尿病患者皮膚中葡萄糖含量增高，皮膚的屏障作用降低，使患者易感染皮膚病，而關(guān)于這種易感性與EGFR是否有關(guān)的報(bào)道很少。

本研究通過(guò)鏈脲佐菌素復(fù)制大鼠糖尿病模型，測(cè)定皮膚中糖和糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products, AGEs）的含量及磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（pEGFR）表達(dá)水平，觀察大鼠皮膚組織病理學(xué)變化，研究pEGFR表達(dá)與糖尿病皮膚病變關(guān)系，探討其機(jī)制，為糖尿病并發(fā)皮膚病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)健康成年SD雄性大鼠，體重（200±20）g（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。鏈脲佐菌素STZ（美國(guó) Sigma公司），SP試劑盒（南京建成公司），pEGFR抗體、抗pEGFR抗體、抗AGEs抗體（美國(guó) Cell Signaling公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的復(fù)制 80只SD大鼠隨機(jī)分為兩組：模型組50只，腹腔注射STZ，72 h后隨機(jī)測(cè)量，血糖量≥16 mmol/L為復(fù)制模型成功；對(duì)照組30只，注射等體積的枸櫞酸緩沖液。在復(fù)制模型后的第3天、第1、2、4、8周5個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取背部皮膚組織4份分別行糖含量、AGEs、EGFR檢測(cè)及HE染色觀察。

1.2.2 糖含量檢測(cè) 分別取等量（約0.1 g）皮膚組織塊，剪碎后加入預(yù)冷的Ba（OH）2，勻漿，3 000 r/min離心10 min后，取上清液，Beckman's 生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)糖含量[9]。糖含量計(jì)算公式如下：

糖含量（mg/g）=上清液體積（ml）×糖濃度（mmol/L）×180×103/皮膚組織塊重量（g）

1.2.3 AGEs檢測(cè) 配制皮膚膠原提取液，通過(guò)酶促反應(yīng)和顯色反應(yīng)，計(jì)算提取液中的羥脯氨酸含量來(lái)反映膠原含量，再用熒光分光光度計(jì)對(duì)糖基化膠原蛋白的熒光進(jìn)行自顯影，通過(guò)糖基化膠原蛋白熒光值來(lái)反映AGEs含量。利用免疫組織化學(xué)和抗AGEs單克隆抗體檢測(cè)AGEs的在皮膚組織中的蓄積部位和密度。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)皮膚組織中EGFR蛋白表達(dá)取下0.5 cm×0.5 cm的皮膚經(jīng)4%甲醛固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)，免疫組織化學(xué)染色按照試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行，光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)皮膚組織中pEGFR蛋白表達(dá) 提取皮膚組織中的總蛋白，SDS-PAGE電泳分離不同蛋白，將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上，室溫下脫脂奶粉封閉2 h，磷酸鹽吐溫緩沖溶液（PBS-T）沖洗，加入一抗4℃過(guò)夜，再加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h，PBS-T沖洗，辣根過(guò)氧化酶顯色，Bio-Rad Co.生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)硝酸纖維膜上的目的條帶進(jìn)行掃描和光密度（OD）值分析。

1.2.6 組織學(xué)觀察 取0.5 cm×0.5 cm的皮膚經(jīng)4%甲醛固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，觀察皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及病理變化。光學(xué)顯微鏡目鏡測(cè)微尺測(cè)量皮膚表皮的厚度，測(cè)得多個(gè)部位求平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠平均血糖值比較

復(fù)制模型第3天，檢測(cè)各組大鼠血糖值，糖尿病模型組大鼠平均血糖值為（22.85±5.21）mmol/L，對(duì)照組平均血糖值為（8.95±2.10）mmol/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.238，P=0.000），糖尿病大鼠血糖值均在16.00 mmol/L以上，復(fù)制模型成功。

2.2 模型組大鼠形態(tài)

復(fù)制糖尿病模型成功的模型組大鼠2周后毛色暗黃，體重下降，皮膚變薄，尿量增多，精神萎靡。

2.3 兩組大鼠皮膚組織中的糖和AGEs含量比較

模型組大鼠皮膚組織中的糖含量和糖基化膠原蛋白熒光值均高于對(duì)照組，且模型組在第2、4、8周時(shí)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組高于對(duì)照組（見表1）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，AGEs在大鼠背部皮膚真皮基質(zhì)中大量表達(dá)，且分布廣泛，甚至連接成片，而正常大鼠表達(dá)量較少，且染色較淺。

2.4 pEGFR蛋白的表達(dá)

免疫反應(yīng)呈陽(yáng)性，pEGFR在皮膚組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，在細(xì)胞核中也有少量表達(dá)，鏡下觀察可見糖尿病大鼠在2周后染色區(qū)域減少且淺染，隨著病程的發(fā)展，淺染區(qū)域越來(lái)越少（見圖1）。Western blotting結(jié)果見圖2，對(duì)照組與糖尿病模型組在不同時(shí)間點(diǎn)均有pEGFR蛋白雜交帶，說(shuō)明有pEGFR的表達(dá)；OD值分析顯示：糖尿病模型組的OD值均比同一時(shí)間對(duì)照組值小，并且在第4、8周時(shí)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 pEGFR蛋白表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

表1 兩組大鼠皮膚中糖含量及糖基化膠原蛋白熒光值比較 （±s）

表1 兩組大鼠皮膚中糖含量及糖基化膠原蛋白熒光值比較 （±s）

組別 n 第3天 第1周 第2周 第4周 第8周糖含量/（mg/g）對(duì)照組 6 0.79±0.12 0.83±0.25 0.90±0.33 0.77±0.20 0.81±0.31模型組 10 0.89±0.11 1.02±0.39 1.45±0.56 1.76±0.67 1.98±0.69 t值 1.704 1.062 2.172 3.484 3.883 P值 0.109 0.305 0.046 0.003 0.001糖基化膠原蛋白熒光值/（u/mg）對(duì)照組 6 19.98±0.45 21.88±1.83 20.34±0.94 24.33±0.45 22.65±0.76模型組 10 23.44±0.78 24.44±0.55 28.85±1.45 30.83±0.97 34.49±0.32 t值 9.842 4.884 12.763 15.296 43.953 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 組織病理學(xué)觀察

圖2 兩組大鼠western blotting結(jié)果

組織切片觀察發(fā)現(xiàn)在第3天、第1周時(shí)皮膚結(jié)構(gòu)變化不明顯，2周后表皮變薄，在第4、8周時(shí)可見復(fù)層排列部分消失（見圖3）。其厚度與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。真皮具有萎縮、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，皮下脂肪部分萎縮甚至消失。

表2 兩組大鼠pEGFR表達(dá)比較 （±s）

表2 兩組大鼠pEGFR表達(dá)比較 （±s）

組別 n 第3天 第1周 第2周 第4周 第8周對(duì)照組 6 5.23±0.56 5.34±0.67 5.77±1.22 5.07±0.42 5.37±1.39模型組 10 5.06±0.53 5.24±0.19 4.96±0.36 4.03±0.91 3.80±0.11 t值 -0.121 0.099 2.083 2.976 3.489 P值 4.341 0.891 1.559 0.021 0.001

圖3 大鼠組織切片 （HE×200）

表3 兩組大鼠表皮厚度比較 （μm，±s）

表3 兩組大鼠表皮厚度比較 （μm，±s）

組別 n 第3天 第1周 第2周 第4周 第8周對(duì)照組 6 20.03±0.41 19.89±0.23 21.12±0.48 21.55±0.86 21.89±0.65模型組 10 20.22±0.72 19.33±1.21 19.02±0.83 17.34±0.78 15.98±0.76 t值 0.587 1.107 5.612 10.071 15.837 P值 0.566 0.286 0.000 0.000 0.000

3 討論

近年來(lái)，糖尿病患者逐年增加，其并發(fā)癥也日益增多[10]。糖尿病可引起皮膚隱形損害，這種內(nèi)源性的損害使皮膚具有易感性，使得機(jī)體免疫功能低下嚴(yán)重者可導(dǎo)致皮膚并發(fā)癥的產(chǎn)生，加重疾病治愈的難度[11]。

本研究對(duì)大鼠皮膚組織中的糖含量及AGEs進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)皮膚組織中2種指標(biāo)均增高，AGEs是由還原性糖和蛋白質(zhì)或氨基酸生成的復(fù)雜混合物。免疫組織化學(xué)和Western blotting結(jié)果顯示皮膚中pEGFR表達(dá)減少，大鼠皮膚組織病理切片發(fā)現(xiàn)表皮變薄，并且隨時(shí)間的增加越來(lái)越明顯，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，真皮萎縮，膠原排列紊亂，皮下脂肪萎縮消失。由此可見，糖尿病大鼠由于糖代謝障礙而導(dǎo)致皮膚組織中糖含量增加，高糖環(huán)境進(jìn)而使AGEs蓄積。有研究表明[13]，糖尿病患者皮膚組織中EGFR數(shù)量、性質(zhì)發(fā)生改變。EGF并不是EGFR的唯一配體，AGEs前體物質(zhì)甲基乙二醛和乙二醛均可與EGFR形成受體復(fù)合物，從而抑制EGFR磷酸化，阻礙受體酪氨酸二聚化，阻斷下游信號(hào)途徑的傳導(dǎo)[14]，從而導(dǎo)致皮膚隱性損害的產(chǎn)生。糖尿病患者皮膚組織中的糖含量及AGEs含量均增高，因此高糖代謝產(chǎn)物可拮抗性的與EGFR結(jié)合，抑制了EGF與其結(jié)合，從而阻礙其作用的發(fā)揮[15]。

綜上所述，由于pEGFR的減少而導(dǎo)致信號(hào)通路傳遞障礙是糖尿病造成皮膚隱性損害和皮膚并發(fā)癥發(fā)生的重要機(jī)制之一，為預(yù)防和治療糖尿病并發(fā)的皮膚病提供理論依據(jù)。