郎小喬 孫勇虎 付希安 孫樂樂 劉 紅 張福仁

I型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1， OMIM：162200)又稱Von Recklinghausen病，是一種常見的常染色體顯性遺傳病，其特征表現(xiàn)為皮膚牛奶咖啡斑、神經(jīng)纖維瘤、腋窩或腹股溝雀斑、Lisch結節(jié)、骨骼異常、學習障礙等。發(fā)病率約為1/3500[1]，其中約50%是自發(fā)突變，成人外顯率接近100%。本研究對3例散發(fā)患者進行基因檢測，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 病例1，女，17歲。7歲時頸部出現(xiàn)咖啡斑，逐漸增大增多，并向軀干、四肢蔓延。17歲時軀干和上肢部位開始出現(xiàn)多個凸起皮膚表面的腫物。皮膚科檢查：全身遍布大小不一的咖啡斑、神經(jīng)纖維瘤，有腋窩、腹股溝雀斑(圖1a、b)?；颊叩艿?、妹妹、父母均正常，否認家族史。病例2，男，44歲。14歲時軀干開始出現(xiàn)咖啡斑和突起皮膚表面的腫物，數(shù)量逐漸增多。皮膚科檢查：全身遍布米粒大咖啡斑和大小不一的神經(jīng)纖維瘤(圖1c、d)?；颊邇鹤?、父母均正常，否認家族史。病例3，女，20歲。自出生起軀干部位發(fā)現(xiàn)多個咖啡斑，后逐漸增大增多。20歲時右大腿根處出現(xiàn)凸起皮膚表面的腫物。皮膚科檢查：全身遍布大小不一的咖啡斑，有腋窩、腹股溝雀斑，軀干散在分布米粒大神經(jīng)纖維瘤，右側腹股溝區(qū)有1 cm×2 cm大神經(jīng)纖維瘤(圖1e、f)?；颊吒改妇?，否認家族史。3例患者均在外院行眼科檢查，未發(fā)現(xiàn)Lisch結節(jié)。本研究經(jīng)過山東省皮膚病與性病防治研究所倫理委員會批準，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 外周血DNA提取 分別抽取3例患者及其5位家屬5 mL外周血，放置于5 mL EDTA抗凝管中，在-80℃保存。使用TGuide Large Volume Blood Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，質控濃度為50 ng/μL,體積為80 μL，A260/A280比值在1.8～2.0之間。同時提取100名無NF1家族史的正常人外周血DNA作為對照組，質控標準同上。

1.3 引物設計與PCR擴增和測序 選用NF1基因cDNA參考序列(NM 001042492)作為轉錄本，利用網(wǎng)頁軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)對NF1基因的58個外顯子設計特異性引物。進行常規(guī)PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化后在ABI 3500 xL Dx Genetic Analyzer測序儀(美國ABI公司)上進行測序。測序結果使用Chromas 2.22軟件進行分析，并與上述所使用的轉錄本序列進行比對。

2 結果

病例1，第39號外顯子發(fā)生堿基G缺失(c.5635delG，圖2a)，造成移碼突變，致使轉錄提前終止(p.Cys1878Leufs*1)。病例2，第47號外顯子大片段缺失(c.7041～7062+4del,圖2b)，造成截斷蛋白產(chǎn)生。病例3，第21號外顯子發(fā)生堿基A、C缺失(c.2714-2715delAC，圖2c)，造成移碼突變，致使轉錄提前終止(p.Asp905Thrfs*1)。上述突變在HGMD數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.org)及近5年發(fā)表的NF1相關文獻中均未發(fā)現(xiàn)相同報道。在3例患者家屬及100名正常對照中均未發(fā)現(xiàn)上述突變。

a、b：病例1軀干部布滿咖啡斑、凸起皮膚表面的神經(jīng)纖維瘤；c、d：病例2軀干部大量的咖啡斑、神經(jīng)纖維瘤；e、f：病例3腋窩雀斑和腹股溝1 cm×2 cm大的神經(jīng)纖維瘤

圖1 患者臨床圖片

a：病例1第39號外顯子發(fā)生堿基G缺失(c.5635delG，p.Cys1878Leufs*1)；b：病例2第47號外顯子大片段缺失(c.7041～7062+4del)；c：病例3第21號外顯子發(fā)生堿基A、C缺失(c.2714-2715delAC，p.Asp905Thrfs*1)；d、e、f：正常對照序列

圖2 患者突變檢測結果

3 討論

現(xiàn)采用的診斷標準為美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)在1988年制定，包括：(1)6個或以上的牛奶咖啡斑， 青春期前直徑大于5mm，青春期后直徑大于15mm。(2)2個及以上任何類型的神經(jīng)纖維瘤，或1個叢狀神經(jīng)纖維瘤。(3)腋窩或腹股溝雀斑。(4)視神經(jīng)膠質瘤。(5)2個及以上虹膜錯構瘤(Lisch結節(jié))。(6)骨損害，如蝶骨翼發(fā)育不良，長骨皮質細線化，有或無假關節(jié)。(7)一級親屬關系中有符合上述標準的NF1。以上標準符合2條即可確診NF1。

神經(jīng)纖維瘤蛋白1(neurofibromin 1，NFl)基因突變已被充分證明可引起NF1[2]。NF1基因位于17q11.2，是最大的基因之一，長度為350kb，包括至少60個外顯子。高度保守的GAP關聯(lián)結構域(GRD)是NF1上的一個重要功能區(qū)域，已被證實由20～27a號外顯子編碼[3，4]。該基因編碼包含2818個氨基酸的神經(jīng)纖維瘤蛋白，此蛋白為原癌基因Ras的負性調控因子，有抑制腫瘤的作用。NF1基因體積龐大，測序難度增大，一項基于109例中國NF1患者研究的突變檢出率為89%[5]。因此診斷一般依靠NIH臨床診斷標準，而不常規(guī)采用基因檢測的方法，但對于不符合NIH臨床診斷標準的疑似患者，以及有遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等需求的患者，進行NFI基因突變檢測是有必要的。到2018年2月為止，人類基因突變數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)已有超過2700種不同的NF1基因突變記錄在內，類型包括錯義突變、剪切位點突變以及插入或缺失導致的框移突變等。其中55%的類型為堿基插入、缺失導致的突變，28%的類型為錯義突變，16%的類型為剪切位點突變。本研究3例新發(fā)突變均為堿基缺失造成截斷蛋白的產(chǎn)生，推測由此影響了蛋白正常功能，導致疾病的發(fā)生。

NF1基因具有高度可變性表達，家族內或不同家族之間都具有顯著表達差異。Sabbagh等[6]通過對來自275個家庭的750例NFl患者的研究發(fā)現(xiàn)，臨床表現(xiàn)的相似度隨血緣關系越遠而降低。即使同一個家庭具有相同突變的不同成員之間，臨床表現(xiàn)也可存有差異。有研究團隊對8對有不同NFl癥狀的同卵雙生子進行研究，發(fā)現(xiàn)同卵雙生子之間NF1基因啟動子存在明顯差異，這可能是導致表現(xiàn)型不同的原因[7]。目前已確定的基因型-表現(xiàn)型關系有3種：(1)框內3 bp大小的堿基缺失(c．2970-2972 delAAT)與臨床上無神經(jīng)纖維瘤的表現(xiàn)相關[8]。(2)大片段NF1基因缺失與大量神經(jīng)纖維瘤、骨骼畸形、認知障礙以及發(fā)生惡性腫瘤等表現(xiàn)相關[9]。(3)包括整段NF1的基因微重復與無典型NFI臨床表現(xiàn)相關，臨床表現(xiàn)有生長遲緩、面部畸形、智力低下、癲癇發(fā)作[10]。

本病目前的治療方法包括手術、藥物、激光等，但均不是一勞永逸的方法，所以產(chǎn)前診斷顯得尤為重要。Merker等[11]報道目前的技術可以幫助超過95%的NFI患者找到突變位點，因此受該病困擾的夫婦可以借助著床前胚胎遺傳學診斷(PGD)來增加生育健康后代的幾率。DeBella等[12]研究發(fā)現(xiàn)有97%的患者在8歲之前符合NIH發(fā)布的NF1診斷標準，烏云等[13]通過基因檢測手段診斷2例僅有多發(fā)咖啡斑表現(xiàn)的無家族史低齡患兒，說明對于學齡前不符合診斷標準的疑似兒童進行基因檢測，在早診斷、早干預方面有重要意義。該病無論從外觀和健康方面對患者均是一種負擔，本文中2例年輕女性患者有下一代產(chǎn)前診斷的需求，檢測突變位點對她們日后優(yōu)生優(yōu)育有一定參考價值。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的3種新發(fā)突變豐富了中國人群NF1基因的突變譜，為NF1相關研究打下基礎。對于臨床表現(xiàn)未達診斷標準以及有遺傳咨詢需求的患者，可以考慮NF1基因突變分析，明確診斷并據(jù)病情發(fā)展行針對性隨訪觀察。