黃 丹 鞠 梅 陳 崑 吳敏智 顧 恒

近年來研究發(fā)現(xiàn)，外源因素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在致皮膚毒性過程中起著關(guān)鍵作用，導(dǎo)致多種皮膚疾病的發(fā)生，比如衰老、皮膚腫瘤、免疫性皮膚病等[1]。LA是類似于維生素B族的一種抗氧化劑，存在于線粒體，具有脂溶性和水溶性，外界補(bǔ)充的LA可到達(dá)細(xì)胞的任何一個(gè)部位，有極強(qiáng)的抗炎以及自由基清除能力，有較好的應(yīng)用前景[2]。近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于糖代謝、糖尿病及其并發(fā)癥、心腦血管和其他多種疾病，但在皮膚科疾病中應(yīng)用較少，為了解該抗氧化劑能否對(duì)人皮膚光損傷產(chǎn)生保護(hù)作用而設(shè)計(jì)了該研究。本研究用UVB制造氧化應(yīng)激模型，探討LA對(duì)紫外線誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。本研究采用過氧化氫來誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)[3,4]，建立人皮膚細(xì)胞的氧化應(yīng)激陽性對(duì)照。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑 細(xì)胞標(biāo)本：原代角質(zhì)形成細(xì)胞取自健康成人包皮環(huán)切術(shù)后的包皮。主要試劑：單丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine, MDC)、MTT、LA、3%過氧化氫溶液、DCFH-DA熒光探針(美國Sigma-Aldrich公司)。胎牛血清(Gibico公司，烏拉圭)，角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(KSFM，美國Gibco公司)，MDA、TAOC試劑盒(南京建成生物工程研究所)，RPMI裂解液(碧云天生物公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備 UVB輻照儀(上海希格瑪高技術(shù)有限公司)，UVB熒光燈管(UVB Broadband PL-S 9W/12，美國飛利浦公司)，全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACSVerseTM Flow Cytometer，美國Bio-Rad公司)，微量高速冷凍離心機(jī)(5810R，德國Eppendorf公司)，超聲細(xì)胞破碎儀(Vcx-130，美國Soics公司)，PK-SB型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 原代KC培養(yǎng)于KSFM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中孵育。取第3～8代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按(5～8)×104/mL密度接種到相應(yīng)的培養(yǎng)皿。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 預(yù)實(shí)驗(yàn)中UVB照射分5、10、20、40和80 mJ/cm25個(gè)劑量梯度，H2O2分為0、0.5、1.0和10.0 mmol/L四個(gè)濃度梯度，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及生長活力，選取UVB 40 mJ/cm2作為照射組，H2O210.0 mmol/L作為陽性對(duì)照組，以及陰性對(duì)照組，共三個(gè)組別。照射組又分為兩個(gè)亞組：一組在照射結(jié)束后加入正常培養(yǎng)基，一組加入含LA終濃度0.5 mmol/L的培養(yǎng)基孵育，分別在4 h、12 h收集細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。陽性對(duì)照組H2O2孵育4 h、12 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.2.3 制作UVB光損傷細(xì)胞模型 細(xì)胞接種在6孔板上，每孔1.5 mL細(xì)胞懸液，搖晃均勻，置于5% CO2孵箱37℃下孵育，約12 h后細(xì)胞貼壁，待細(xì)胞增殖鋪滿80%～90%培養(yǎng)皿底時(shí)進(jìn)行UVB照射處理。照射前用槍頭吸去上清，預(yù)熱的PBS緩沖液沖洗一遍，每孔加入適量PBS，使薄層液體覆蓋細(xì)胞。使用本課題組定制的UVB細(xì)胞照射裝置，光源選用平行布置的9支飛利浦寬波UVB熒光燈管(Philips UVB Broadband PL-S 9W/12)。照射前打開光源預(yù)熱10 min，使輸出光源能量穩(wěn)定，經(jīng)UVB輻照儀測(cè)量校訂，選取輻照強(qiáng)度相對(duì)最為均衡的照射平面(距熒光燈管16 cm處)，平均輻照強(qiáng)度通常在1.50 mW/cm2左右。根據(jù)需要的照射量計(jì)算出照射時(shí)間，設(shè)置時(shí)間，開始照光，照射結(jié)束后吸去PBS。照射時(shí)周圍的孔用遮光紙完全遮蓋。陰性對(duì)照孔除不照光，其他處理同照射組。

1.2.4 H2O2制作陽性對(duì)照：細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底80%～90%時(shí)加入含10 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基，分別在重新孵育后4、12 h終止孵育，PBS清洗兩遍，進(jìn)行下一步處理。

1.2.5 LA干預(yù) LA干粉加入無水乙醇配成0.5 mol/L的母液，分裝4℃保存，使用時(shí)按照1∶1000直接用培養(yǎng)基稀釋成終濃度500 μmol/L的試驗(yàn)用終濃度。

1.2.6 2’7’-二氯熒光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)染色測(cè)定活性氧自由基(ROS) 去除培養(yǎng)基，加入稀釋好的DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μmmol/L，37℃孵箱里孵育30 min，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，用胰酶將細(xì)胞消化下來。DCFH被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化成高熒光強(qiáng)度的DCF(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)該熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度的變化，并用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)綠色熒光進(jìn)行定量。

1.2.7 化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA和TAOC 預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，RPMI裂解液于冰上裂解細(xì)胞，10000 rpm離心10 min，取上清液，-20℃保存待測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

1.2.8.1 觀察指標(biāo) 倒置熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察各組細(xì)胞形態(tài)以及DCFH-DA染色后熒光強(qiáng)度變化，并用配套的成像拍照設(shè)備拍攝圖片。綠色熒光定量、MDA和TAOC濃度均以計(jì)量資料體現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 UVB照射后角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)變化

2.1.1 UVB照射 原代角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)照射后，較陰性對(duì)照組細(xì)胞，漂浮死亡的細(xì)胞逐漸增多，貼壁的細(xì)胞部分失去正常的膜結(jié)構(gòu)，折光度變差?？傮w上照射后12 h的細(xì)胞形態(tài)較4 h有所恢復(fù)。見圖1a～1c。

2.1.2 H2O2孵育 經(jīng)10 mmol/L H2O2作用4 h后細(xì)胞間隙增寬、死亡的細(xì)胞增多，作用到12 h細(xì)胞密度又恢復(fù)正常，但細(xì)胞輪廓欠清，有較多漂浮死亡的細(xì)胞。見圖1d～1f。

2.2 DCF-DA染色法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS產(chǎn)生水平 40 mJ/cm2UVB照射后4 h細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度較對(duì)照組增強(qiáng)，提示ROS產(chǎn)生增多，照射后即刻加LA孵育4 h后肉眼見熒光強(qiáng)度有所減弱，但仍較對(duì)照組強(qiáng)。見圖2。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)綠色熒光強(qiáng)度，照射后4 h，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與H2O2陽性對(duì)照相當(dāng)[(35311±3072.3) vs. (37075±2049.8)]，均較陰性對(duì)照組明顯升高(24465±2085.3,P<0.001)，加LA干預(yù)后熒光強(qiáng)度下降至接近陰性對(duì)照組水平(26926±3502.7,P>0.05)，提示ROS產(chǎn)生減少。

從圖3看出，UVB照射后12 h，即使未使用LA干預(yù)，熒光強(qiáng)度較照射后4 h也有較顯著的下降(P=0.006)，加抗氧化劑LA孵育后熒光值較未加抗氧化劑差別仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(28253.33±2288.0)vs. (24500±2203.20),P=0.002]。單因素方差分析顯示除陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組有顯著差異外(P<0.001)，其余組與陰性對(duì)照組均無顯著性差異。見表1。

2.3 MDA檢測(cè)結(jié)果 各組及各時(shí)間點(diǎn)MDA的趨勢(shì)與ROS的變化趨勢(shì)相當(dāng)， 40 mJ/cm2UVB照射后4 h，與陰性對(duì)照組之間差別有顯著性差別[(11.61±0.68) vs (8.25±1.21) nmoL/mg·prot，P=0.004 )]，照射后12 h，MDA有所下降[(9.95±1.17)nmoL/mg·prot]，但仍較陰性對(duì)照組高；無論是照射后4 h還是12 h，經(jīng)過LA干預(yù)后MDA值均得到下降，以40 mJ照射后LA孵育4 h后MDA下降更為明顯(P=0.019)。見圖4，表1。

2.4 TAOC檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)得的A值計(jì)算出各組TAOC濃度，單因素方差分析，F(xiàn)=0.518，LSD檢驗(yàn)兩兩比較均P>0.05，各組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1，圖5。提示各組總抗氧化能力無顯著差異。

MDA單因素方差分析F=4.695，對(duì)照組和H2O2之間、對(duì)照組和40 mJ/cm2UVB照射后4 h之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，40 mJ/cm2UVB照射后4 h與12 h之間P=0.031，照射后4 h、12 h后加LA與未加LA 孵育兩組間均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組兩兩之間均顯著無統(tǒng)計(jì)意義。TAOC統(tǒng)計(jì)分析各組之間均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 UVB照射或者H2O2孵育后細(xì)胞的形態(tài)變化 a：原代角質(zhì)形成細(xì)胞；b,c:40 mJ/cm2UVB照射原代角質(zhì)形成細(xì)胞后4、12 h后部分貼壁的細(xì)胞部分失去正常的膜結(jié)構(gòu)，折光度變差；d：原代角質(zhì)形成細(xì)胞；e,f:10 mmol/L H2O2溶液作用4 h后細(xì)胞間隙增寬、死亡的細(xì)胞增多，作用到12 h細(xì)胞密度又恢復(fù)正常，但細(xì)胞輪廓欠清，有較多漂浮死亡的細(xì)胞

圖2 DCF-DA染色效果圖 a、b、c圖依次為對(duì)照組、UVB照射組、UVB照射+LA治療組，可見后兩組綠色熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，提示ROS產(chǎn)生增多，c組熒光較b組有所減弱

圖3 UVB照射后4、12 h原代角質(zhì)形成細(xì)胞DCFH-DA染色顯示ROS熒光強(qiáng)度的對(duì)比圖4 UVB照射后4、12 h，LA孵育4、12 h原代角質(zhì)形成細(xì)胞MDA濃度對(duì)比圖5 UVB照射后4、12 h，LA孵育4、12 h原代角質(zhì)形成細(xì)胞總抗氧化能力，各組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

表1 原代角質(zhì)形成細(xì)胞DCFH-DA染色后DCF熒光強(qiáng)度、化學(xué)法檢測(cè)MDA和TAOC濃度

注：n=3。流式細(xì)胞儀檢測(cè)原代角質(zhì)形成細(xì)胞DCFH-DA染色后DCF熒光強(qiáng)度，單因素方差分析，F(xiàn)=13.352，陽性對(duì)照組、照射后4 h組ROS強(qiáng)度與陰性對(duì)照組均有顯著差異(P<0.001)，照射后12 h組較4 h組ROS下降有顯著差異(P=0.006)；照射后加抗氧化劑LA孵育4 h ROS下降較未加抗氧化劑組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)

3 討論

正常的皮膚細(xì)胞由于新陳代謝產(chǎn)生少量的O2-、H2O2，UVA和UVB照射后通過直接作用和間接作用產(chǎn)生大量的ROS，包括超氧陰離子、單線態(tài)氧、過氧化氫和羥自由基。細(xì)胞內(nèi)存在固有的抗氧化防御系統(tǒng)，有清除ROS的作用，包括超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽過氧化物酶等酶類；以及谷胱甘肽(GSH)、尿酸、輔酶Q和泛醌等活性物質(zhì)[3]。如果ROS不能被抗氧化系統(tǒng)及時(shí)拮抗，則會(huì)通過循環(huán)系統(tǒng)至其他組織和細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而誘導(dǎo)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物和嘧啶二聚體等的產(chǎn)生，引起ERK1/2、p38 MAPK、JNK和NF-kappaB等信號(hào)通路的異常激活[5]，這些異常激活的信號(hào)通路將造成對(duì)組織分化增殖和損傷炎癥過程的異常調(diào)控，參與UVB介導(dǎo)的凋亡、光誘導(dǎo)腫瘤、光敏感性皮膚病和光老化的發(fā)生。要降低自由基對(duì)人體的危害，除了依靠體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)外還要尋找和發(fā)掘外源性自由基清除劑。

臨床常用的抗氧化劑如維生素C為水溶性，抑制細(xì)胞釋放氧自由基，清除細(xì)胞周圍氧自由基、提高過氧化氫酶谷胱甘肽還原酶活性，主要在生物水溶性腔隙中發(fā)揮較強(qiáng)的抗氧化作用；維生素E為脂溶性，主要保護(hù)細(xì)胞膜受到脂質(zhì)過氧化損傷，需要在其他抗氧化劑如維生素C的協(xié)同下再循環(huán)利用[2]。而LA同時(shí)具有脂溶性和水溶性，是線粒體a-酮酸氧化脫氫酶的一個(gè)輔助因子，LA能夠還原內(nèi)源性抗氧化劑如維生素C、維生素E和谷胱甘肽，螯合鐵、銅和其他金屬，與這些金屬離子穩(wěn)定結(jié)合，抑制這些金屬催化的脂質(zhì)過氧化。LA的還原態(tài)二硫辛酸(DHLA)通過清除體內(nèi)的氧自由基和動(dòng)員機(jī)體內(nèi)源性的抗氧化劑如維生素C、維生素E和谷胱甘肽的生成發(fā)揮抗氧化作用[6,7]，作為新一代的抗氧化劑LA和DHLA一起被譽(yù)為“萬能抗氧化劑”，有廣泛的應(yīng)用前景。近年來有數(shù)個(gè)小規(guī)模的臨床研究報(bào)道局部外用5%的LA制劑有效改善面部的光老化現(xiàn)象，包括皮膚粗糙、細(xì)紋、暗沉，并抑制UV導(dǎo)致的皮膚曬傷，減少角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡[8,9]。但在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞LA抗氧化應(yīng)激的的機(jī)理研究仍非常少。

本研究設(shè)置了外源性H2O2孵育組作為陽性對(duì)照組，運(yùn)用UVB照射誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激壓力，從氧化損傷水平和抗氧化水平檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化體系，結(jié)果證實(shí)40 mJ/cm2UVB能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，相當(dāng)于10 mmol/L H2O2的氧化效果。流式細(xì)胞儀技術(shù)將染色后激發(fā)的綠色熒光準(zhǔn)確定量，表明40 mJ/cm2的UVB照射后4 h細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平較陰性對(duì)照組升高約30%～40%，與既往研究結(jié)果相一致[10]，隨著時(shí)間的推移ROS有自行下降的趨勢(shì)。照射后經(jīng)過抗氧化劑LA的處理，ROS下降的更為迅速。(見圖2和表1)。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)被活性氧氧化的產(chǎn)物，是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激損傷程度的重要標(biāo)志物，過度累計(jì)可直接反應(yīng)受氧化應(yīng)激損傷的程度。本研究結(jié)果顯示MDA的變化趨勢(shì)與ROS一致，抗氧化劑LA干預(yù)后MDA下降的更為顯著，體現(xiàn)了UVB誘導(dǎo)的急性光損傷以及LA的抗氧化應(yīng)激以及對(duì)抗光氧化損傷效應(yīng)。研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，LA與正常的角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)4 h、12 h，ROS和MDA含量較陰性對(duì)照組并沒有發(fā)生明顯變化(數(shù)據(jù)未列出)，可能LA沒有改變內(nèi)環(huán)境正常細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，在氧化壓力增高時(shí)才發(fā)揮抗氧化作用。

在抗氧化體系檢測(cè)方面，結(jié)果顯示UVB照射后各組細(xì)胞的總抗氧化能力均未發(fā)生顯著變化(見圖5和表1)。分析原因，可能是角質(zhì)形成細(xì)胞抗氧化酶整體水平表達(dá)低下，難以出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，提示我們今后需要進(jìn)一步的研究，更準(zhǔn)確的對(duì)抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行定量。

綜上所述，本部分研究證實(shí)了UVB照射能夠引起原代角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，與10 mmol/L的過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的陽性對(duì)照結(jié)果一致，LA通過降低ROS和MDA含量能夠有效的減輕UVB照射引起的氧化應(yīng)激損傷。實(shí)際上LA作為一種天然抗氧化劑，其廣譜抗氧化能力能夠?qū)苟喾N氧化損傷帶來的病理生理損傷，值得深入研究。