付芳惠 付希安 王真真 于功奇 劉 紅 張福仁

IL36Ra是IL-36α、IL-36β及 IL-36γ的受體拮抗劑，通過與IL-36受體結(jié)合抑制核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 信號(hào)通路及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 途徑下游促炎信號(hào)的活化[1]。自2011年Marrakchi等人首次報(bào)道IL36RN突變導(dǎo)致IL-36Ra的功能減弱或喪失，引起泛發(fā)性膿皰型銀屑病(GPP)的發(fā)生后，多項(xiàng)遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其突變具有種族異質(zhì)性[1-4]。隨后，有學(xué)者對(duì)IL36RN與局限性膿皰型銀屑病的相關(guān)性進(jìn)行討論，包括掌跖膿皰病(palmoplantar pustulosis，PPP)和連續(xù)性肢端皮炎(acrodermatitis continua of Hallopeau，ACH)[5]。PPP是一種局限于掌跖部位的慢性炎癥性皮膚病，臨床表現(xiàn)為紅斑基礎(chǔ)上周期性發(fā)生的無菌性膿皰，伴角化、鱗屑。目前，關(guān)于IL36RN與PPP的相關(guān)性存在爭議。M?ssner等[6]發(fā)現(xiàn)在歐洲人群中IL36RN與PPP不相關(guān)。日本學(xué)者對(duì)88例PPP患者的IL36RN基因測序報(bào)道了相似的結(jié)果[7]。然而，在14例中國PPP中發(fā)現(xiàn)2例患者攜帶c.115 + 6T>C突變[2]。為進(jìn)一步明確IL36RN與中國人群PPP的相關(guān)性，我們收集了96例PPP患者和144名健康志愿者，對(duì)其進(jìn)行了IL36RN基因測序，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 為2014年1月至2017年12月在我院就診的96例PPP患者和144名健康志愿者。病例組和對(duì)照組的平均年齡分別為(51.23±11.94)歲和(50.05±11.12)歲。病例組的男女比例為1∶3，對(duì)照組為5∶11。兩組之間年齡和性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者由我院2名經(jīng)驗(yàn)豐富的皮膚科專家根據(jù)臨床表現(xiàn)和組織病理確診。本研究得到了山東省皮膚病性病防治研究所倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 用EDTAK2抗凝管抽取5mL外周靜脈血，根據(jù)TGuide大體積血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)操作步驟提取外周全血DNA。使用全波長紫外/可見光掃描分光光度計(jì)ND-8000(NanoDrop公司)測定DNA濃度及純度，根據(jù)DNA原液濃度將DNA原液標(biāo)化為30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增 使用NCBI(National Center of Biotechnology Information)/Primer-BLAST對(duì)IL36RN(參考號(hào)NM_012275.2)全部外顯子及其兩端側(cè)翼序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，由北京華大基因研究中心合成，引物序列詳見表1。PCR采用12.5μL反應(yīng)體系：Taq Mix(包括dNTP、Taq酶和緩沖液)6.5μL，滅活的去離子水ddH2O 5μL，上下游引物(F+R)0.5μL，模板DNA 0.7 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性10 min：94℃變性30 s，退火45s(退火溫度詳見表1)，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.2.3 DNA測序 采用乙醇醋酸鈉純化法純化所有陽性擴(kuò)增條帶的樣本。分離純化后的DNA采用雙脫氧鏈終止法(Sanger測序法)，在ABI 3500XL DNA測序分析儀(美國Applied Biosystem公司)上進(jìn)行基因測序。用Chromas軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析，并將測序結(jié)果與NCBI下載的參考序列同時(shí)輸入NCBI Nucleotide BLAST中進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件包22.0版本處理。除了描述性數(shù)據(jù)，定量資料若符合正態(tài)分布，以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，若不符合，則以中位數(shù)和四分位間距(IQR)表示或百分比(頻率)表示。定性資料采用Pearson’s卡方檢驗(yàn)或Fisher’s精確檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 本研究共包括96例PPP患者，其中男24例，女72例，男女比例為1∶3 ，平均發(fā)病年齡為(49.53±12.07)歲。

2.2 IL36RN測序結(jié)果 對(duì)96例PPP患者和144名健康對(duì)照者進(jìn)行IL36RN基因測序，共檢測到2個(gè)已知的突變位點(diǎn)：c.115+6T>C(p.Arg10ArgX1)雜合突變和c.140A>G(p.Asn47Ser)雜合突變。見圖1。96例PPP患者中有6(6.3%)例患者攜帶突變，其中3例患者攜帶c.115+6T>C， 3例攜帶c.140A>G。144名健康對(duì)照者中共有6(4.2%)名攜帶突變，2名攜帶c.115+6T>C，4名攜帶c.140A>G。PPP組與健康對(duì)照組IL36RN突變率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.67，OR=0.65，95%CI:0.20～2.09)。

圖1 a：c.115+6T>C 雜合突變；b：c. 140A>G 雜合突變

外顯子引物序列5’-3’退火溫度(℃)片段大小(bp)2上游5-’CTCAGCCTCTCTCTCCATGATT-3’下游5’-CGGGTCTATCCAGAACTCACTT-3’581643上游5’- TGCTGTTACTTCTGGCACAGT-3’下游5’-CCAAGGAAAGTGGGTCATGT-3’582494上游5’-CTGCTGAGAAGCCTCCCTTC-3’下游5’-CTGAGTCCCCAGTGAGGATG-3’582935上游5’-GATTCTGTTGATGGCAGCTTT-3’下游5’-CATGGGTCTCCTCCACTCAC-3’58396

3 討論

PPP是一種以掌跖部位反復(fù)發(fā)生無菌性膿皰為特征的炎癥性皮膚病，好發(fā)于中老年女性，其發(fā)病率為0.05%～0.1%[8]。本研究中PPP平均發(fā)病年齡為(49.53±12.07)歲，女性是男性的3倍，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道相似[9]。

PPP的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，研究證實(shí)遺傳因素在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。由于PPP和GPP同屬于膿皰型銀屑病，因此有學(xué)者把GPP的致病基因在PPP中進(jìn)行驗(yàn)證。2011年Marrakchi等利用純合子定位和直接測序法對(duì)9個(gè)GPP突尼斯家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)IL-36RN是常染色體隱性遺傳GPP的致病基因。IL36RN屬于IL-1家族，主要在皮膚中表達(dá)，編碼 IL36受體拮抗劑(IL36-Ra)。IL36-Ra通過與IL-1受體樣2受體(IL-1RL2)結(jié)合，參與激活促炎癥信號(hào)NF-κB及和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，阻礙IL-36細(xì)胞因子(IL-36α、IL-36β、IL-36γ)炎癥作用。當(dāng)IL36RN發(fā)生突變時(shí)，其編碼的IL-36Ra結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，對(duì) IL-1RL2的拮抗能力減弱甚至喪失，而IL-36α、IL-36β、IL-36γ與IL-1RL2的結(jié)合則相應(yīng)增加，通過激活下游促炎癥信號(hào)通路，最終引起皮膚的炎癥反應(yīng)[1，11]。2013年Setta-Kaffetzi等在139例歐洲PPP患者中發(fā)現(xiàn)7例攜帶IL36RN突變，證實(shí)PPP與IL36RN相關(guān)[5]。2015年M?ssner的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)251例歐洲PPP患者進(jìn)行IL36RN基因的篩查，檢測到4例患者攜帶突變。雖然基于Setta-Kaffetzi等研究的等位基因頻率和效應(yīng)量，該研究有大于99.999%的效能來檢測PPP與IL36RN突變等位基因之間的關(guān)聯(lián)，但是其研究并沒有得到IL36RN突變與PPP發(fā)病相關(guān)的證據(jù)支持[6]。隨后，日本團(tuán)隊(duì)也報(bào)道IL36RN突變不是PPP的決定性致病因素[7]。然而，有學(xué)者在14例中國PPP中發(fā)現(xiàn)2例患者攜帶c.115 + 6T>C突變[2]。為進(jìn)一步明確IL36RN與中國人群PPP的相關(guān)性，我們對(duì)96例中國漢族PPP患者和144名健康對(duì)照進(jìn)行IL36RN測序，發(fā)現(xiàn)PPP組與健康對(duì)照組IL36RN突變率相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.67，OR=0.65，95%CI:0.20～2.09)。本研究中PPP組和正常對(duì)照組中c.140A>G的突變等位基因頻率分別為0.015和0.013。在人類遺傳變異數(shù)據(jù)庫( Human Genetic Variant Database)的1142個(gè)樣本中共50個(gè)攜帶c.140A>G雜合突變，突變等位基因頻率為0.022。PPP組與二者相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此我們認(rèn)為此突變與PPP不相關(guān)。c.115 + 6T>C是亞洲人群中最常見的突變，位于IL36RN基因3號(hào)外顯子下游的內(nèi)含子區(qū)域，突變影響3號(hào)外顯子的剪接，導(dǎo)致截短蛋白的合成，影響IL36Ra的功能[12]。我國臺(tái)灣學(xué)者曾報(bào)道此突變與PPP相關(guān)，其OR值為15.8[2]。本研究在96例PPP患者中發(fā)現(xiàn)3例攜帶c.115+6T>C，基于臺(tái)灣學(xué)者研究中的等位基因頻率和效應(yīng)量，我們有88.76%的效能檢測突變與PPP的相關(guān)性。我們的研究并不支持IL36RN基因與PPP發(fā)病相關(guān)，與歐洲、日本的研究結(jié)果一致。