孔 永 顏天銘 王玉玉 沈立軍 王 婧 邱玉華

(蘇州大學醫(yī)學部免疫學系，蘇州 215123)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由21～23 bp雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)介導的轉錄后基因沉默機制[1]，采用RNAi技術可特異性抑制樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)表面共刺激分子表達，使其維持未成熟狀態(tài)和致免疫耐受性能，對于誘導機體免疫耐受、治療移植排異及自身免疫性疾病等具有重要的意義[2]。

DC是機體內(nèi)功能最強和唯一能直接激活初始T細胞的專職性抗原遞呈細胞(Antigen presenting cell,APC)，其在免疫應答/調節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[3，4]。在正常生理情況下，機體內(nèi)多為未成熟DC(immature DC,iDC)，其表面中度表達MHCⅡ、不或低度表達B7-1/B7-2等共刺激分子，因其無法有效提供共刺激信號而不能激活T細胞，從而導致其凋亡、無能以及促進機體免疫耐受的產(chǎn)生[5]。在病理狀態(tài)下，機體內(nèi)炎性環(huán)境及抗原刺激DC發(fā)育成熟(mature DC,mDC)，導致T細胞活化增殖與免疫應答，從而促進疾病的發(fā)展[6]。

鑒此，本文構建慢病毒載體及介導小鼠B7-2基因RNAi，并研究其對DC表面B7-2的干擾效應以及對DC免疫性能的影響，為后續(xù)制備耐受性DC及應用于自身免疫性疾病模型的免疫干預研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料 293T細胞(ATCC)；6～8周齡C57BL/6小鼠(蘇州大學實驗動物中心)；慢病毒載體系統(tǒng)(上海吉瑪制藥)；氨芐青霉素(Solarbio)；FBS及RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)；Lipofectamine2000 (Invitrogen)；限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶(TaKaRa)；PE標記抗小鼠CD11c、MHCⅡ、B7-1及B7-2抗體(Biolegend)；Polybrene、MTT、LPS及DMSO(Sigma)；瑞氏染色試劑盒(碧云天生物)；重組小鼠GM-CSF及IL-4(Proptech)；尼龍毛柱(Polysciences)。

1.2方法

1.2.1序列選擇與雙發(fā)夾RNA模板設計 從GenBank鼠B7-2基因(NM_019388)的編碼區(qū)中選擇3段RNA干擾的靶序列：①長度為21個核苷酸；②GC含量30%～50%，不含連續(xù)的4個及以上T；③避免選擇起始密碼子下游和終止密碼子上游100個核苷酸區(qū)域序列；④將靶序列在數(shù)據(jù)庫中進行比較，確保與其他基因無同源性；⑤選擇與小鼠B7-2無同源性序列作為檢驗RNAi特異性的陰性對照。雙發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)模板由靶序列正向序列和反向互補序列通過環(huán)序列(TTCAAGAGA)相連接，并以6個T作為轉錄終止信號，同時在序列兩端分別添加BamHⅠ及EcoRⅠ酶切位點。所設計DNA寡核苷酸序列由上海吉瑪公司合成。

1.2.2慢病毒表達載體的構建 將合成的DNA寡核苷酸序列進行退火形成shRNA前體DNA鏈。慢病毒表達載體經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切線性化后在T4 DNA連接酶作用下與模板雙鏈DNA進行連接，隨后連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)DH5α菌并置于氨芐LB培養(yǎng)基中進行克隆培養(yǎng)，每靶點隨機挑取20個陽性克隆送Genescript公司進行DNA測序鑒定。

1.2.3重組慢病毒的制備與滴度測定 293T細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，待其處于對數(shù)期及60%～70%匯合時，重組慢病毒表達質粒及包裝輔助質粒在Lipofectamine2000介導下共轉染細胞12 h，更換含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集48 h及72 h的培養(yǎng)上清，于4℃及50 000 g超高速離心2 h進行濃縮。濃縮慢病毒經(jīng)10倍梯度稀釋感染293T后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，計數(shù)GFP陽性細胞數(shù)目并計算病毒滴度：病毒滴度(TU/ml)=(計數(shù)孔GFP+細胞數(shù)/感染病毒體積)×稀釋倍數(shù)。

1.2.4小鼠骨髓源DC的培養(yǎng)與鑒定 無菌分離C57BL/6小鼠脛、股骨，沖洗骨腔獲得骨髓，以200目篩網(wǎng)制備細胞懸液，隨后采用紅細胞裂解液處理及培養(yǎng)液洗滌獲得小鼠骨髓細胞懸液。調整細胞濃度至1×106ml-1，2 ml/孔接種于24孔板中并添加GM-CSF(20 ng/ml)及IL-4 (10 ng/ml)，培養(yǎng)48 h后輕輕晃動培養(yǎng)板，吸棄懸浮細胞，更換新鮮培養(yǎng)基(含GM-CSF及IL-4)繼續(xù)培養(yǎng)。隔日更換培養(yǎng)基，第6天換液時添加LPS(1 μg/ml)進行成熟刺激，第8天收獲細胞。期間顯微鏡下監(jiān)控細胞生長狀態(tài)；收集第8天細胞流式分析其表面CD11c、MHCⅡ、B7-1及B7-2的表達情況。

1.2.5重組慢病毒對DC感染效率的測定 參照1.2.4操作分離培養(yǎng)DC并于第6天時在Polybrene(5 ng/ml)輔助下慢病毒(LV-NC)以不同感染復數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)(0、5、10、20、40、60)進行感染12 h，隨后換液繼續(xù)培養(yǎng)60 h，熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況并流式測定感染效率。

1.2.6重組B7-2基因RNAi慢病毒感染對DC表面B7-2表達的沉默效果及有效B7-2基因RNAi慢病毒的篩選 根據(jù)感染效率測定結果優(yōu)化感染條件后，3靶點RNAi慢病毒感染DC后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，流式分析其對細胞表面B7-2的沉默狀況以及確定具有最佳干擾效果的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒。

1.2.7重組B7-2基因RNAi慢病毒感染及沉默DC表面B7-2表達對DC免疫性能的影響 在96孔板中每孔接種2×104個慢病毒感染DC作為刺激細胞及2×105個尼龍毛柱吸附純化的小鼠脾臟T細胞作為反應細胞共培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結束前4 h時每孔加入終濃度0.5 mg/ml的MTT溶液，結束培養(yǎng)時棄除培養(yǎng)基并加入150 μl/孔 DMSO溶解結晶物并測定A490值。

2 結果

2.1重組慢病毒表達載體的構建 在小鼠B7-2基因編碼區(qū)選擇了3段RNAi靶序列，根據(jù)首個堿基的位置分別命名為139、425、848。隨后設計合成shRNA模板DNA序列并克隆至慢病毒表達載體，經(jīng)測序鑒定重組載體中插入序列結構及組成符合設計要求(圖1)。

2.2重組慢病毒的制備與滴度測定 重組慢病毒表達載體質粒與包裝輔助質粒在脂質體介導下共轉染293T細胞，培養(yǎng)24 h及48 h后可見GFP大量表達及重組病毒的成功包裝(圖2)，收獲48 h及72 h的培養(yǎng)上清并進行超高速離心，病毒液得到濃縮，濃縮病毒液經(jīng)梯度稀釋感染293T細胞及檢測轉基因GFP的表達情況確定其滴度為(2～4)×108TU/ml(圖3)。

2.3小鼠骨髓源DC的培養(yǎng)與鑒定 小鼠骨髓細胞接種于培養(yǎng)板后，光鏡下可見大小不一的細胞(圖4A)；第2天可見少量粒細胞集落形成(圖4B)；第3天集落繼續(xù)增多(圖4C)，此時輕輕晃動培養(yǎng)板，傾去培養(yǎng)基以及懸浮細胞繼續(xù)培養(yǎng)；第4天時可見具有伸展突起的巨噬細胞和少量成簇懸浮生長的幼稚DC(圖4D)；第5天集落中可見表面粗糙及具有少量細胞突起的DC(圖4E)；第6天時，集落中的DC開始釋放及懸浮生長并逐漸出現(xiàn)自發(fā)成熟的傾向(圖4F)，此時加入LPS進行刺激培養(yǎng)。第7天時，DC表面刺突清晰明顯(圖4G)。第8天多數(shù)DC從集落中釋放，懸浮DC明顯增多，形態(tài)較大且刺突明顯，呈典型的樹突狀細胞形態(tài)(圖4H)。經(jīng)瑞氏染色后可見LPS刺激前(圖4I)后(圖4J)DC表面刺突變化明顯，LPS刺激后的DC呈典型的成熟形態(tài)。流式細胞分析表明LPS刺激前DC表面表達MHCⅡ(56.4%)、B7-1(15.2%)、B7-2(21.8%)及CD11c(64.7%)，經(jīng)LPS刺激成熟后MHCⅡ、B7-1、B7-2表達率上調，分別為84.0%、71.6%、74.0%(圖5)。

2.4重組慢病毒對小鼠骨髓源DC的感染效率測定 將收獲的第6天DC用重組慢病毒LV-NC以不同的MOI進行感染并培養(yǎng)72 h以使轉基因充分表達。熒光顯微鏡下觀察顯示隨著感染MOI的增加，表達GFP的DC逐漸增多(圖6)，同時流式細胞分析結果也表明感染效率的提高，在MOI為5、10、20、40、60時感染效率分別為7.1%、25.3%、62.2%、72.8%及86.4%。

2.5重組B7-2基因RNAi慢病毒感染對DC表面B7-2表達的沉默效果分析 參照陰性對照慢病毒對DC的感染效率，重組慢病毒LV-139、LV-425、LV-848及LV-NC以MO為80感染DC及培養(yǎng)72 h，流式分析各組重組慢病毒對DC表面B7-2的干擾效率，結果顯示(圖7)：感染效率進一步提高至90%以上，LV-139、LV-425、LV-848感染后DC表面B7-2分子的表達率分別下降至4.3%、3.8%和6.3%，而LV-NC感染組B7-2分子表達率無明顯變化(73.2% vs 71.0%)。根據(jù)以上結果確定LV-425為具有最佳干擾效果的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒。

圖1 小鼠B7-2 RNAi重組慢病毒表達載體測序結果Fig.1 DNA sequencing of recombinant lentiviral vector specific for mouse B7-2 RNAi

圖2 慢病毒包裝過程中GFP的表達(48 h，×100)Fig.2 GFP expression in lentivirus packaging progress(48 h，×100)

圖3 重組慢病毒滴度測定(×100)Fig.3 Titration of recombinant lentivirus(×100)

圖4 體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源DC形態(tài)的變化(×400)Fig.4 Morphological changes of mouse BM-DCs in progress of culture in vitro(×400)

圖5 小鼠骨髓源DC的表型分析Fig.5 Phenotypic analysis of mouse BM-DCs

2.6重組B7-2基因RNAi慢病毒感染及沉默DC表面B7-2表達對DC免疫性能的影響 收獲LPS刺激成熟和經(jīng)LV-425或LV-NC感染的DC作為刺激細胞，以小鼠脾臟T細胞作為反應細胞，二者比例為 1∶10 進行混合淋巴細胞反應，共培養(yǎng)72 h后采用MTT測定細胞增殖的狀況，結果顯示(圖8)：LV-425感染及沉默B7-2表達后DC刺激T的增殖能力顯著下降(P<0.05)。

圖6 重組慢病毒LV-NC對小鼠骨髓源DC的感染效率Fig.6 Infection efficiency of recombinant lentivirus LV-NC on mouse BM-DCs

圖7 小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒對小鼠骨髓源DC表面B7-2分子表達的沉默效果分析Fig.7 Silencing efficiency analysis of recombinant lentivirus for mouse B7-2 gene RNAi on expression of membrane B7-2 molecules in mouse BM-DCs

圖8 重組慢病毒感染抑制小鼠骨髓源DC誘導的T細胞增殖反應Fig.8 Inhibitory effects of recombinant lentivirus on mouse bone marrow derived dendritic cell induced T cell proliferationNote: *.P<0.05.

3 討論

1973年，Steinman等[7]首次從小鼠脾臟中分離出DC，隨著研究的不斷深入，DC在免疫應答調節(jié)以及免疫耐受誘導中發(fā)揮的功能逐漸被重視[3,4]。未成熟DC具有強大的抗原攝取及加工處理能力，但由于其表面MHCⅡ、B7-1、B7-2、ICAM-1、CD40等弱表達，不能為T細胞活化提供有效的第一信號和共刺激信號，從而導致特異性T細胞無反應、發(fā)生凋亡或產(chǎn)生調節(jié)性T細胞進而誘導免疫耐受的發(fā)生[5]。由于未成熟狀態(tài)的DC具有致免疫耐受的能力，因而采用基因修飾的方法維持DC的未成熟狀態(tài)或部分抑制其免疫刺激能力，能夠在器官移植排異和自身免疫病的防治中起到積極的作用[8]。

慢病毒載體介導的RNAi技術具有慢病毒的感染細胞譜廣泛、可感染分裂期和靜止期細胞、高感染效率等特點以及RNAi的特異性沉默性能，成為DC基因修飾及誘導免疫耐受的理想手段[2]。

B7-2是B7家族的重要成員和經(jīng)典的共刺激分子，該分子與T細胞表面的CD28結合所轉導的細胞信號對于免疫反應初期T細胞應答與否具有關鍵作用，是T細胞啟動免疫所必需的[3,4]。因此，本研究選擇B7-2作為DC修飾和免疫干預的靶點，構建小鼠B7-2基因RNA干擾的shRNA重組慢病毒載體，采用四質粒慢病毒載體系統(tǒng)(LV-H1-GFP-B7-2-shRNA、GAG/POL、LV-REV及LV-VSV-G)共轉染293T細胞進行慢病毒的包裝制備。由于本研究中的慢病毒系統(tǒng)使用的是水泡性口炎病毒G糖蛋白(Vesicular stomatitis virus glycoprotein,VSV-G)改型的包膜質粒，使得重組慢病毒顆粒的穩(wěn)定性提高[9]，因此，我們采用超高速離心的方法對其進行濃縮以提高滴度，隨后本研究采用可以反映具有感染活性病毒的細胞生物學方法測定病毒滴度。

為進一步研究小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒對DC表面B7-2分子表達沉默效果和誘導其免疫耐受的作用，我們從6～8周齡的C57BL/6小鼠脛骨、股骨中分離富含CD34+干/祖細胞的骨髓細胞，采用細胞因子(GM-CSF、IL-4)誘生法進行誘導培養(yǎng)，根據(jù)DC的半黏附生長，T、B細胞及粒細胞懸浮生長，而巨噬細胞黏附生長的特性，在骨髓細胞培養(yǎng)48 h后輕輕晃動培養(yǎng)板以使T、B細胞及粒細胞懸浮進而吸棄，培養(yǎng)至第6天用LPS刺激48 h，集落中細胞體積增大，表面突起明顯，并逐漸從集落中釋放，吹打培養(yǎng)板使疏松貼壁的細胞充分懸浮，即獲得大量DC。經(jīng)顯微鏡下動態(tài)觀察及瑞氏染色鑒定，本法制備的DC表面刺突明顯，為典型的成熟狀態(tài)。同時本研究選擇CD11c、MHCⅡ、B7-1及B7-2組合標記以鑒定所培養(yǎng)的DC，流式分析結果顯示其表達率分別達68.5%、84.0%、1.6%及77.40%，該DC在混合淋巴細胞反應中也顯示出了刺激小鼠脾臟T淋巴細胞增殖的能力，說明本方法成功制備的DC為成熟的功能性DC。

慢病毒載體既可感染分裂細胞又可感染靜止期細胞，對DC有較高的感染效率[10]，本研究制備的重組慢病毒以不同MOI感染DC，通過GFP標記觀察轉基因的表達情況并流式分析病毒感染效率，結果表明，隨著MOI的增加其感染效率逐漸升高，經(jīng)過優(yōu)化條件后感染效率可達90%以上。

本研究隨后采用小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒LV-139、LV-425、LV848及LV-NC感染小鼠骨髓源DC，結果顯示：其表面B7-2分子的表達率由71%分別下降至4.3%(LV-139)、3.8%(LV-425)及6.3%(LV-848)，而LV-NC感染組B7-2表達無明顯變化(73.2% vs 71.0%)，這表明了本研究制備的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒可有效沉默B7-2分子的表達。同時混合淋巴細胞培養(yǎng)的結果顯示：經(jīng)篩選獲得的具有最佳效果的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒(LV-425)感染后可以顯著抑制DC刺激小鼠脾臟T細胞增殖的能力，說明該重組慢病毒誘導的B7-2沉默能抑制B7-2所介導的共刺激信號與DC刺激T細胞免疫應答的能力，使DC獲得免疫耐受性能。

綜上，本研究制備了針對小鼠B7-2基因RNAi的重組慢病毒，其可高效感染體外誘導小鼠骨髓源DC、沉默DC表面B7-2表達及誘使DC具備免疫耐受性能。本研究為采用慢病毒載體介導B7-2基因沉默的方式修飾DC及誘導其免疫耐受應用于病理性免疫耐受失衡的自身免疫性疾病、器官移植排異治療研究提供了新的實驗依據(jù)。