陳楠楠

（蘇州大學(xué)，江蘇蘇州 215000）

在CRISPER-Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建之前，人們已找到兩種可以特異性切斷DNA雙鏈的酶，一種是鋅指核酸酶（ZFNs），另一種是利用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）。ZFNs是由多個(gè)鋅指基序串聯(lián)成的DNA識(shí)別域和非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ的羧基端功能域組成的融合蛋白，當(dāng)兩個(gè)ZFN分別結(jié)合到DNA的兩條鏈上間隔5～7個(gè)堿基的靶序列后，進(jìn)而激活FokⅠ核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域，使DNA在特定位點(diǎn)產(chǎn)生雙鏈斷裂。但是，鋅指基序同其靶序列的對(duì)應(yīng)性并不特異，而且在基因組上找到合適的ZFN靶點(diǎn)也比較困難。TALENs是將特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域TALE代替ZFNs的鋅指基序改造而成，但是TALE的識(shí)別位點(diǎn)有限。CRISPR/Cas9技術(shù)有效的利用了RNA-DNA的特異配對(duì)特性，并簡(jiǎn)化了設(shè)計(jì)過(guò)程，使應(yīng)用范圍更廣泛。

1 CRISPR序列的發(fā)現(xiàn)（1987—2002年）

1987年，日本的Nakata實(shí)驗(yàn)室在分析大腸桿菌基因iap及臨近序列時(shí)發(fā)現(xiàn)在iap基因的3'端存在多個(gè)含有29個(gè)堿基且高度同源的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列之間包含32個(gè)堿基的間隔序列。真正對(duì)這些序列著迷的是FranciscoMojica。他的導(dǎo)師在前期研究中發(fā)現(xiàn)鹽的濃度會(huì)影響Haloferaxmediterranei DNA酶切片段的大小，Mojica便尋其中的原因。他在分析DNA片段的序列時(shí)發(fā)現(xiàn)了與Nakata實(shí)驗(yàn)室所發(fā)現(xiàn)序列類似的“重復(fù)-居間序列-重復(fù)”序列[1]。隨后的幾年里，Mojica在多種微生物中都找到了類似的序列，并意識(shí)到這些序列可能在微生物中發(fā)揮重要作用。后來(lái)，Mojica將這種“重復(fù)-居間序列-重復(fù)”序列命名為SRSRs。到2000年，Mojica在20種不同的微生物基因組中發(fā)現(xiàn)了類似序列[2]。兩年后，Ruud Jansen在研究這些序列過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了許多與其關(guān)聯(lián)的核酸酶。與Mojica交流后，這種序列結(jié)構(gòu)被正式命名為CRISPR，與之相關(guān)的核酸酶則被命名為Cas[3]。雖然人們鑒定到了大量CRISPR序列，但對(duì)其生物學(xué)功能則毫無(wú)所知。

2 CRISPR功能的初步探索（2002—2005年）

得益于數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷豐富，在2003年，Mojica通過(guò)BLAST發(fā)現(xiàn)來(lái)自E.coli的居間序列能匹配侵染E.coli的P1噬菌體序列，而包含這些居間序列的E.coli菌株對(duì)P1噬菌體具有顯著的抗性。經(jīng)過(guò)一周的艱苦努力，Mojica分析了4500條居間序列，找到了88條有資料可查的序列，其中2/3的序列為病毒或外源質(zhì)粒的序列，他意識(shí)到CRISPR/Cas系統(tǒng)可能與細(xì)菌的獲得性免疫有關(guān)[4]。同一時(shí)期，法國(guó)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室也分別獨(dú)立得出了類似的結(jié)論。就職于法國(guó)國(guó)防部的Gilles Vergnaud在分析61份Y.pestis樣本后，得出了與Mojica一致的結(jié)論，即CRISPR與細(xì)菌的獲得性免疫有關(guān)[5]。同時(shí)，Alexander Bolotin提出了微生物中CRISPR序列染色體外起源的假說(shuō)[6]。

3 CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)的解析和建立（2005—2012年）

2005年開始，CRISPR得到了更多的重視。2005年，Philippe Horvath等在法國(guó)羅地亞食品公司成立了一個(gè)研究小組，研究Mojica等人提出的CRISPR可能與細(xì)菌的獲得性免疫相關(guān)的假說(shuō)。他們建立了由一個(gè)對(duì)噬菌體敏感的S.thermophilus菌株和兩個(gè)噬菌體組成的研究體系，發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)噬菌體抗性的獲得與菌株CRISPR位點(diǎn)獲得噬菌體來(lái)源的序列相關(guān)[7]，當(dāng)噬菌體中相應(yīng)的序列發(fā)生突變后，該菌株的噬菌體抗體則喪失。在后續(xù)的研究中，他們收集了大量具有不同程度免疫缺陷的菌株，并利用這些資源證實(shí)Cas7對(duì)菌株在CRISPR位點(diǎn)獲得噬菌體來(lái)源的序列是必需的，而與序列獲得后的抗性無(wú)關(guān)；而酶學(xué)專家VirginijusSiksnys證實(shí)，Cas9對(duì)菌株維持噬菌體抗性是必需的[6]。同一時(shí)期，在瓦格寧根大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室中，John van der Oost和EugeneKoonin合作，利用E.coli建立了另外一個(gè)研究CRISPR與細(xì)菌獲得性免疫關(guān)系的研究系統(tǒng)，并分析了其中的5個(gè)Cas蛋白（Cascade）的功能[8]。他們發(fā)現(xiàn)Cas能將CRISPR位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄來(lái)的RNA前體剪接為61個(gè)堿基大小的成熟crRNA（CRISPR RNA）。為了驗(yàn)證crRNA對(duì)于CRISPR介導(dǎo)的免疫抗性是必需的，他們?cè)诩?xì)菌中建立了第一個(gè)人工CRISPR/Cas系統(tǒng)，證實(shí)了其介導(dǎo)細(xì)菌抗噬菌體的能力，并猜測(cè)crRNA靶向DNA而不是傳統(tǒng)認(rèn)為的anti-RNA。

證實(shí)CRISPR系統(tǒng)靶向DNA的是盧西亞諾·馬拉夫尼（Luciano Marraffini）等人。馬拉夫尼在芝加哥大學(xué)攻讀博士學(xué)位時(shí)，接受了噬菌體遺傳學(xué)權(quán)威人物Malcolm Casadaban的建議著手研究CRISPR。當(dāng)時(shí)人們已普遍懷疑CRISPR anti-RNA理論，于是馬拉夫尼大膽推測(cè)，CRISPR能像限制性內(nèi)切酶一樣直接切割DNA。后來(lái)，馬拉夫尼與Erik Sontheimer合作，證實(shí)CRISPR可以像抵御病毒一樣破壞轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒[9]。為了進(jìn)一步證實(shí)此事，他們構(gòu)建了一個(gè)體外CRISPR免疫系統(tǒng)，確證CRISPR靶向DNA。他們甚至通過(guò)改造CRISPR免疫系統(tǒng)，在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)染色質(zhì)DNA的剪切。但馬拉夫尼等人在設(shè)計(jì)這些實(shí)驗(yàn)時(shí)并不知道是哪個(gè)Cas起到了DNA內(nèi)切酶的功能，這導(dǎo)致了他們的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)存在大量問(wèn)題，因此沒(méi)有引起人們的重視。最終，Sylvain Moineau等人利用手中的免疫缺陷菌株研究發(fā)現(xiàn)切割質(zhì)粒取決于Cas9核酸酶。當(dāng)他們對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)切割發(fā)生在PAM序列上游3個(gè)核苷酸處，這一關(guān)鍵序列特征與他們?cè)缙谡撐闹兴枋龅囊恢耓10]。

盡管CRISPR/CAS9系統(tǒng)已經(jīng)完整，但還有一個(gè)謎團(tuán)，即被稱為trans-activating CRISPR RNA（tracrRNA）的小RNA。tracrRNA最早由Emmanuelle Charpentier在病原菌中發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)J?rgVogel分析發(fā)現(xiàn)該小RNA是由緊鄰CRISPR的序列轉(zhuǎn)錄而來(lái)，并包含一個(gè)由25個(gè)堿基組成，與CRISPR序列互補(bǔ)的序列。后經(jīng)基因敲出實(shí)驗(yàn)證明，tracrRNA指導(dǎo)crRNA的成熟過(guò)程[11]。后經(jīng)Siksnys等人的研究表明，tracrRNA還有另一個(gè)關(guān)鍵作用，即對(duì)于Cas9核酸酶復(fù)合物的形成是必需的[12-13]。就在Siksnys等人解析Cas9的酶學(xué)結(jié)構(gòu)時(shí)，Charpentier與結(jié)構(gòu)生物學(xué)家JenniferDoudna開展合作，發(fā)現(xiàn)從E.coli中純化的Cas9能與純化的crRNA和tracrRNA在體外形成功能復(fù)合體，更重要的是，他們發(fā)現(xiàn)將crRNA和tracrRNA融合成一條RNA（sgRNA）時(shí)，Cas9復(fù)合體的功能不受影響，并指出“該系統(tǒng)在RNA指導(dǎo)的基因組編輯方面具有巨大潛力”[12]。

4 CRISPR/Cas9技術(shù)的歷史性突破（2012—2013年）

在解析CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)的過(guò)程中，有兩件具有里程碑意義的成果，即CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)在不同微生物間的移植和在體外的成功重建。在接下來(lái)的研究中，科學(xué)家張峰取得了首屈一指的成果。當(dāng)時(shí)TALENs研究剛興起，張峰等人與來(lái)自SangamoBioSciences的另一實(shí)驗(yàn)室分別成功地將TALENs應(yīng)用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。2011年2月，張峰首次接觸到CRIAPR/Cas9系統(tǒng)，兩個(gè)月后他便在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了sgRNA介導(dǎo)的熒光報(bào)告基因的表達(dá)調(diào)控，但效果并不理想。接下來(lái)的一年中，張峰對(duì)CRIAPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。2012年，他建立了一個(gè)由Cas9、tracrRNA和CRISPR序列三種元件組成的基因調(diào)控系統(tǒng)，以及包含16個(gè)基因的CRISPR文庫(kù)。他發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)可以同時(shí)準(zhǔn)確高效地突變多個(gè)基因序列。接下來(lái)，他檢測(cè)了由Cas9和sgRNA兩種元件組成的系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)sgRNA的3'端發(fā)夾結(jié)構(gòu)在激活Cas9的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。

5 后CRISPR/Cas9時(shí)代（2013年至今）

自CRISPR/Cas9技術(shù)被證明可以高效準(zhǔn)確編輯哺乳動(dòng)物基因序列后，關(guān)于CRISPR/Cas9的科學(xué)報(bào)道迅速席卷生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，CRISPR/Cas9技術(shù)在應(yīng)用方面實(shí)現(xiàn)迅猛拓展，概括來(lái)講可以分為基因組編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA調(diào)控及基因組定位。除了科研領(lǐng)域，CRISPR/Cas9還對(duì)社會(huì)思想帶來(lái)了巨大沖擊，特別是基因編輯嬰兒的誕生，引發(fā)了關(guān)于CRISPR/Cas9倫理的廣泛討論。但無(wú)論如何，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)為人類戰(zhàn)勝遺傳性疾病及癌癥等嚴(yán)重疾病帶來(lái)了新的希望，具有不可估量的價(jià)值。