鐘 燁，劉春輝，蘇軍濤，劉 洋，田 煒，王曉濤，張國志

0 引 言

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲狀腺腫瘤中最常見的病理類型，近年來發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢[1-2]。雖然診療技術(shù)的發(fā)展使患者的生存率提高，但部分患者預(yù)后差，尤其是老年和兒童PTC患者復(fù)發(fā)率高且預(yù)后生活質(zhì)量下降[3-4]。目前PTC的治療主要采用手術(shù)切除和放射性I131，其中放射性I131可能會導(dǎo)致永久性甲狀腺功能減退，而手術(shù)治療的患者可出現(xiàn)呼吸困難和窒息等嚴(yán)重的并發(fā)癥。因此近年來分子生物靶向的治療方法成為了該領(lǐng)域研究的熱點。PTC的發(fā)病過程是由多種基因，多種因素共同作用的結(jié)果。FOX基因包括100多個基因家族成員，主要亞家族有FOXA、FOXB～FOXQ，其共同特征是具有高度保守的Forkhead結(jié)構(gòu)域，大約含有100個氨基酸叉頭區(qū)DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域；其中FOXQ1是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子中重要的家族成員[5-6]。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子FOXQ1與多種腫瘤的發(fā)病機制密切相關(guān)，F(xiàn)OXQ1在乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、卵巢癌等腫瘤中表達上調(diào)，可通過影響下游基因調(diào)控細胞信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與多種腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移、增殖等生物學(xué)功能[6-8]。有關(guān)FOXQ1在PTC發(fā)生發(fā)展上的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究利用小干擾RNA技術(shù)，觀察沉默TPC-1細胞中FOXQ1基因?qū)TC細胞增殖的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞由天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院饋贈，取處于對數(shù)生長期的細胞加入10%～15%胎牛血清(FBS)DMEM(高糖)培養(yǎng)基、置于5% CO2、37 ℃恒溫的細胞孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2材料人工合成3對FOXQ1-siRNA和無義序列RAN(蘇州吉瑪基因有限公司)，SYBR Green qPCR Master Mix、FOXQ1引物及l(fā)ipofectamineTM2000(美國 Invitrogen公司)，RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京GenStar公司)，兔抗人FOXQ1多克隆抗體、一抗cyclinD1和c-Myc(英國Abcam公司)，內(nèi)參GAPDH 抗體和western試劑盒(上海碧云天公司)，高分辨率倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，qRT-PCR儀器(中國香港Gene Company Iimited公司)。

1.3檢測FOXQ1-siRNA轉(zhuǎn)染細胞的干擾效率取傳代次數(shù)在5代以內(nèi)且處于對數(shù)生長期的細胞，將細胞輕輕吹打成單細胞懸液后均勻接種于6孔板中(3×105/孔)，置于37 ℃恒溫細胞孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)，待融合率達到60%～80%時進行下一步實驗。用于轉(zhuǎn)染的NC-siRAN和3條人工合成的FOXQ1序列如下：NC-siRAN(sense 5'-3' UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，antisense 5'-3' ACGUGACACGUUCGGAGAATT)；FOXQ1-1(sense 5'-3' UCGACAGCAUCCUGCGCAATT，antisense 5'-3' UUGCGCAGGAUGCUGUCGATT)；FOXQ1-2(sense 5'-3' GCAAGGACAACUACUGGAUTT，antisense 5'-3' AUCCAGUAGUUGUCCUUGCTT)；FOXQ3-siRNA(sense 5'-3' GCACGCAGCAAGCCAUAUATT，antisense 5'-3' UAUAUGGCUUGCUGCGUGCTT)。實驗分組：空白對照組(加入等量的磷酸鹽緩沖液)、NC-siRAN組(轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA)、FOXQ1-1組(空白培養(yǎng)基+ lipofectamineTM2000+ FOXQ1-1)、FOXQ1-2組(空白培養(yǎng)基+ lipofectamineTM2000+FOXQ1-2)、FOXQ1-3組(空白培養(yǎng)基+lipofectamineTM2000+FOXQ1-3)。每組設(shè)置3個復(fù)孔，在同等條件下將siRNA轉(zhuǎn)染至TPC-1細胞，置于恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)6 h，磷酸鹽緩沖液沖洗2次，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72 h在熒光倒置顯微鏡觀察細胞熒光蛋白的表達效率，當(dāng)干擾效率達到85%以上時繼續(xù)培養(yǎng)各組細胞，進一步評估3條不同的FOXQ1-siRNA序列的干擾效率。

1.4qRT-PCR檢測FOXQ1、cyclinD1、c-Myc的mRNA相對表達水平轉(zhuǎn)染48 h后，使用TRIpure 法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，利用qRT-PCR儀器進行PCR擴增，每組設(shè)置3個復(fù)孔。擴增條件是預(yù)變性95 ℃、20 s，變性95 ℃、5 s， 60 ℃、30 s，延伸72 ℃、40 s，40個循環(huán)。PCR擴增FOXQ1的CT值均經(jīng)內(nèi)參GAPDH校正，然后采用2-ΔΔCT法分布計算FOXQ1、cyclinD1、c-Myc 的mRNA相對表達水平。平行實驗3次。

1.5Westernblotting檢測細胞FOXQ1、cyclinD1、c-Myc蛋白的表達水平按照試劑盒說明書提取細胞總的蛋白，BCA法進行蛋白定量，100 ℃蛋白變性5 min后，-80 ℃保持，按照蛋白量30 μg/泳道上樣，SDS-PAGE電泳90 min，待轉(zhuǎn)膜完成后封閉2 h，分別加入一抗 FOXQ1(1∶500)、 cyclinD1 (1∶1000)、c-Myc (1∶1000)、GAPDH(1∶1000)。4 ℃孵育過夜，次日0.1%TBST洗膜完成后加入二抗(1∶1000)，常溫孵育1 h，洗膜完成后，分別加入適量顯色劑用AI600化學(xué)發(fā)光成像儀(美國GE公司)成像。以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析條帶的灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.6MTT法檢測細胞的增殖活性變化首先將各組細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)后，用胰蛋白酶消化后將細胞密度調(diào)整為3×104/mL的單細胞懸液，以3×103/孔的細胞密度均勻接種于96孔板，在孔板四周分別加上等量的PBS，置于恒溫細胞孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h，每組設(shè)置4個復(fù)孔。不同的時間段分別在孔中加入10 μL MTT溶液(濃度為5 mg/mL)，恒溫37 ℃細胞培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h后，棄培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL/孔，繼續(xù)置于恒溫箱中針對反應(yīng)10 min。用酶標(biāo)儀于波長490 nm測量各孔吸光度(即A值)，A值表示細胞的增殖活性。A值大小與各孔細胞存活數(shù)成正比。

2 結(jié) 果

2.1PTC中FOXQ1的表達情況Western blot結(jié)果顯示，TPC-1細胞FOXQ1蛋白的表達量(0.89±0.04)明顯高于人甲狀腺正常細胞Nthy-ori3-1中表達量(0.51±0.07)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2FOXQ1-siRNA轉(zhuǎn)染TPC-1細胞的干擾效果

2.2.1倒置熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達情況無意義序列和序列基因中siRNA轉(zhuǎn)染到TPC-1細胞中48 h細胞的轉(zhuǎn)染效率均可達85%以上，見圖2。

圖 1 不同細胞中FOXQ1的表達水平

a：無意義序列基因；b：序列基因

2.2.2qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細胞后各組中FOXQ1mRNA的相對表達水平與空白對照組、NC-siRNA組比較， FOXQ1-3組明顯抑制FOXQ1mRNA的表達(P<0.05)。見表1。

2.2.3Westernblot法檢測轉(zhuǎn)染TPC-1細胞各組中蛋白的相對表達水平FOXQ1-1組、FOXQ1-2組、FOXQ-3組FOXQ1蛋白表達量較NC-siRNA組明顯降低，F(xiàn)OXQ1-3組下降最為明顯(P<0.05)；FOXQ1-3組較空白對照組亦明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.3cyclinD1、c-Myc蛋白及mRNA表達的比較與空白對照組、NC-siRNA組c-Myc、cyclinD1蛋白及mRNA的相對表達量比較，F(xiàn)OXQ1-3組明顯降低(P<0.05)。見表1，圖3。

2.4MTT法檢測各組細胞增殖活性的變化與空白對照組、NC-siRAN組比較，F(xiàn)OXQ1-3組可明顯抑制TPC-1細胞的增殖活性(P<0.05)，見表2。

表 1 轉(zhuǎn)染后各組mRNA及蛋白的表達比較

與FOXQ1-3組比較，*P<0.05

1：空白對照組； 2：NC-siRNA組; 3:FOXQ1-3組

表 2 不同時間段各組細胞A值的比較

與FOXQ1-3組比較，*P<0.05

3 討 論

FOXQ1基因作為FOX家族中的重要成員，參與調(diào)控腫瘤的形成、細胞增殖、特定組織的基因表達、細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)行為[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1在PTC組織中異常高表達，該基因與PTC的發(fā)病機制密切相關(guān)，在PTC中可能具有促癌作用[12]。這些研究提示FOXQ1有可能是PTC分子生物治療的關(guān)鍵性因子。小干擾RAN是一種核酸序列特異性阻滯基因功能的有效工具， 通過組裝、RISC的活化、目標(biāo)識別和切割這四個方面從而達到抑制基因表達的作用[13-14]。siRNA主要通過瞬時轉(zhuǎn)染降解mRNA阻止其翻譯成蛋白質(zhì)，或在某些情況下阻止靶基因的轉(zhuǎn)錄從而達到特定基因沉默的效果[15]。本研究將人工合成的3條FOXQ1-siRNA和NC-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染PTC TPC-1細胞，熒光顯微鏡觀察細胞中熒光蛋白表達的轉(zhuǎn)染率達到85%以上，qRT-PCR和Western blot進一步驗證結(jié)果顯示FOXQ1-3組可以明顯抑制PTC TPC-1細胞中FOXQ1表達，從而篩選出有效的干擾序列。本研究進一步探討沉默F(xiàn)OXQ1基因?qū)PC-1細胞增殖的影響及其可能的機制。

研究表明，腫瘤細胞增殖主要基于細胞周期相關(guān)蛋白的異常表達，細胞周期重要的調(diào)控蛋白cyclinD1與G1期密切相關(guān)，可以促使轉(zhuǎn)錄因子與細胞增殖的相關(guān)因子結(jié)合，其異常表達可以阻止G1期向S期轉(zhuǎn)換，進而抑制細胞的增殖活性[16-18]。在PTC中細胞周期蛋白cyclinD1明顯高于癌旁的正常組織，該蛋白異常表達與腫瘤的增殖密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色[19]。c-Myc是原癌基因，在甲狀腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌中均存在高表達，降低c-Myc基因的表達水平可抑制腫瘤細胞的增殖活性[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌和乳腺癌中，抑制FOXQ1基因的表達可以減弱腫瘤的形成和生長[22]，因此本研究進一步探討了沉默F(xiàn)OXQ1基因，有效的干擾序列FOXQ1-3可以明顯抑制PTC TPC-1細胞的增殖活性(P<0.05)。這與在結(jié)直腸癌、胃癌和肝癌中通過靶向FOXQ1基因的表達，可以明顯抑制細胞的增殖活性的研究結(jié)果相一致[23-25]。進一步本研究證實了FOXQ1-siRNA抑制TPC-1細胞的增殖活性，其機制可能與cyclinD1、c-Myc蛋白的表達變化有關(guān)。

總之，本研究表明FOXQ1基因在PTC的發(fā)生、發(fā)展扮演著重要的角色，有可能是PTC分子靶向的治療新靶點。但是在PTC中，F(xiàn)OXQ1參與細胞信號通路的調(diào)控機制有待于我們進一步深入研究。