李一君,劉哲鵬

上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院(上海，200093)

0 引言

神經(jīng)損傷是一種全球普遍性的疾病，影響著全世界數(shù)百萬人，尤其對于青壯年來說，這可能會使他們患有認知、運動或精神上的永久性殘疾，導致其社會和經(jīng)濟負擔增加，降低其生活質(zhì)量[1]。盡管成年哺乳動物周圍神經(jīng)系統(tǒng)具有自我再生能力，但如果不采用治療干擾，自發(fā)神經(jīng)再生有極大可能會導致神經(jīng)功能不全[2]。

周圍神經(jīng)損傷的治療方法大致分為三種：直接端對端縫合，自體移植和組織工程化神經(jīng)移植物。直接縫合受損神經(jīng)的成功率高達70%，但是神經(jīng)末端無法過度拉伸，較大的損傷間隙(>5 mm)則需要替代技術[3]。采用自體移植的方法治療大間隙周圍神經(jīng)損傷，在一定程度上能夠降低排異反應，但移植過程中切除的腓腸神經(jīng)可能導致疼痛敏感性降低甚至喪失[4-5]。組織工程化神經(jīng)移植物的出現(xiàn)可以替代傳統(tǒng)的神經(jīng)吻合術來治療神經(jīng)損傷，一些實驗和臨床前研究已經(jīng)報道了使用組織工程化神經(jīng)移植物作為自體神經(jīng)移植物的替代物來橋接周圍神經(jīng)缺損的可行性[6]。組織工程化神經(jīng)移植物培養(yǎng)過程中必不可缺的就是組織工程支架，支架既可以作為體外細胞生長分化的依靠，又可以直接植入受損部位促進神經(jīng)，在組織工程中占據(jù)了重要地位。

常見的組織工程支架制備方式有：自組裝[7]、3D打印[8]、靜電紡絲[10]等。自組裝過程簡單高效也在智能神經(jīng)納米支架方面取得了一定的進展，但是其產(chǎn)生的不良反應較多，而且其形貌外觀可控性較差[7]。3D打印法設計多樣化，能夠精準地復制設計結(jié)構(gòu)，但是對材料要求較高部分材料無法使用該方法，且微納米級的3D打印設備價格高昂[9]。而與其他幾種方法相比，靜電紡絲可以制備出均勻連續(xù)的微米或納米纖維，且制備方法簡單，纖維尺寸可控，對于材料的要求不高，因此，在組織工程支架制備中占據(jù)重要地位。

1 紡絲材料對神經(jīng)修復的影響

細胞外基質(zhì)不僅影響控制細胞行為，還為組織提供結(jié)構(gòu)和機械支持[10]。作為組織工程支架不僅需要有適宜的降解速率、理化性質(zhì)和力學性能，還需要在結(jié)構(gòu)和功能上與細胞外基質(zhì)相似，有利于細胞粘附和生長。

1.1 單一材料

天然材料的空間結(jié)構(gòu)與細胞周圍的大分子非常相似，在支架設計方面具有一定先天的優(yōu)勢。常用的天然聚合物有膠原蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖、藻酸鹽等[11-13]。殼聚糖其表面具有豐富的正電荷基團有助于神經(jīng)前體細胞的長期存活。Du等[9]將人神經(jīng)干細胞接種于制備的殼聚糖、醋酸纖維素和聚醚砜紡絲支架上，培養(yǎng)1天后，細胞在殼聚糖支架上粘附情況最好，與其他兩組相比具有顯著性差異。7天后，殼聚糖組神經(jīng)元基因表達明顯高于其他兩組，且大部分細胞分化為具有長軸突的成熟神經(jīng)元，而聚醚砜組細胞基本處于未分化狀態(tài)。

合成高分子聚合物具有良好的生物降解性、力學特性和理化性能，且易于人工控制，有利于支架為細胞生長提供長久的支撐力。左旋聚乳酸(PLLA)納米支架結(jié)構(gòu)與神經(jīng)細胞的天然細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)類似而被廣泛用于神經(jīng)組織工程，其制備的纖維支架能夠指導細胞延伸和遷移[14]。Nisbet等[15]制備了聚己內(nèi)酯紡絲支架并植入小鼠腦部，3天后附著在纖維上的小膠質(zhì)細胞數(shù)量達到峰值，與此同時星形膠質(zhì)細胞活化，14天后炎癥開始消退，60天支架未引起異物反應，證實了PCL與腦神經(jīng)組織的相容性良好。此外，常用于神經(jīng)組織工程的材料還有聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚吡咯(PPY)等[1,16-17]。

1.2 復合材料

由于大部分天然高聚物的降解速度較快，不能長期支持細胞的生長分化；而擁有較慢降解速率的合成高聚物，由于自身的疏水特性其細胞親和力不強，細胞粘附性較差。且有研究表明，在純的高聚物支架上培養(yǎng)神經(jīng)細胞，神經(jīng)突觸丟失，細胞擴散較少，且沒有典型表型[18]。因此，近年來研究者們多使用復合材料來獲取擁有更好性能的細胞支架。Binan等[19]在PLLA和明膠共紡絲纖維上培養(yǎng)神經(jīng)干樣細胞，細胞成功增殖，2天后開始有神經(jīng)突觸分化，14天后神經(jīng)元分化與對照組相比具有顯著性差異，主要原因是纖維表面明膠層能夠確保支架具有良好的細胞親和力，而PLLA核心可以保證支架能夠維持良好的機械性能。在不改變明膠組分前提下，Karbalaei Mahdi等[20]將PLLA替換為具有更久降解時間的PCL，用于人誘導多能干細胞(hiPSC)的神經(jīng)分化，1天后混紡組細胞活力與對照組具有顯著性差異，且3天內(nèi)沒有任何細胞死亡，14天后實驗組hiPSCs完全分化為神經(jīng)細胞，種種實驗表明，混紡支架是一種可行的且易于獲得的復合材料支架，能夠進一步用于組織工程實驗。

為了獲取更綜合的材料特性，Saravani等[21]將自制的半結(jié)晶聚甘油癸二酸酯聚合物在不同條件下與不同濃度的殼聚糖和明膠混合進行靜電紡絲，對比發(fā)現(xiàn)，明膠的加入使纖維更均勻，而且容易獲得更高的孔隙率。種PC12細胞24小時后實驗組細胞增殖數(shù)量明顯高于對照區(qū)；72小時后，細胞增殖數(shù)量最多的是明膠含量最高的靜電紡絲支架。因此，可以認為聚甘油癸二酸酯/殼聚糖/明膠納米復合支架可以用于神經(jīng)組織工程應用，適量的增加明膠的比例可以增強細胞活力。

2 紡絲結(jié)構(gòu)對神經(jīng)修復的影響

2.1 纖維表面結(jié)構(gòu)

由于纖維表面形貌影響材料的微觀行為，在聚合物表面上產(chǎn)生納米級表面特征，模擬活組織的自然粗糙度，能夠促進細胞生長和增殖。Zamani等[22]制造了獨特的PLGA納米纖維結(jié)構(gòu)，將支架制備成具有光滑和粗糙表面的圓柱形和帶狀纖維。將人膠質(zhì)母細胞瘤細胞接種于纖維上用于評價細胞活力，與平滑和常規(guī)電紡支架相比，PLGA電紡支架的納米粗糙度可以將細胞生長速率提高至50%，粗糙的圓柱形支架增強了神經(jīng)的生長和增殖，同時還發(fā)現(xiàn)細胞增殖和表面特征之間存在一定的線性相互作用。

角蛋白(KOS)，廣泛存在于腦灰質(zhì)、脊髓和視網(wǎng)膜神經(jīng)中，具有改善聚合物納米纖維生物相容性和生物活性的潛力。然而，由于角蛋白的可紡性差，在共混納米纖維中添加角蛋白會降低納米纖維的機械性能，會導致角蛋白在納米纖維內(nèi)的分布不均勻。而Guo等[23]采用表面涂布的方式將角蛋白納米粒子(KNPs)通過電噴霧沉積的方式涂布于PVA靜電紡絲納米纖維，并用于PC12和C6細胞培養(yǎng)。結(jié)果表明，與PVA納米纖維和KOS/PVA共混納米纖維相比，KNPs/PVA納米纖維在細胞形態(tài)、粘附和增殖方面表現(xiàn)出更好的細胞生物相容性。

2.2 纖維空間結(jié)構(gòu)

早期Yang等[24]通過研究發(fā)現(xiàn)靜電紡絲制備的納米纖維支架不僅具有類似于天然細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而且能夠支持神經(jīng)干細胞的增殖、分化和粘附。與微米級纖維相比，納米級纖維促進細胞生長分化的作用，更為突出。目前，已有研究表明定向排列的纖維能夠誘導神經(jīng)細胞的分化，促進神經(jīng)突觸的生長[25]。Zhu等[26]結(jié)合了靜電紡絲和靜電噴霧技術，在具有高度排列的PCL微纖維框架上嵌入具有核殼結(jié)構(gòu)的PLGA生物活性因子納米球，用于細胞培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)，高度對齊的支架增加了神經(jīng)突的長度和沿纖維方向伸長的定向神經(jīng)突。Lins等[27]將神經(jīng)干細胞接種在未對齊和對齊的支架上，細胞接種后，無序纖維上神經(jīng)細胞伸長方向也呈現(xiàn)隨機狀態(tài)且特征分化不明顯；而對齊纖維上細胞伸長方向與纖維方向基本水平，神經(jīng)突觸生長速率明顯優(yōu)于無序纖維。根據(jù)纖維排列的函數(shù)結(jié)果顯示，在對齊纖維上神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中神經(jīng)突觸的生長和分化能力的顯著變化得到證實。綜上所述，有序的纖維支架可以作為神經(jīng)細胞存活和分化的指導性支架。

細胞生長是一個三維立體的過程，具有空間結(jié)構(gòu)的支架更有利于細胞的生長分化。Jakobsson等[28]制備了帶有金屬探針的兩個同軸圓形鐵環(huán)用來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的平面收集版，來獲得具有三維結(jié)構(gòu)的紡絲支架，而且可以通過調(diào)整探針的長度和位置，來調(diào)整纖維支架的形態(tài)。接種人類神經(jīng)干細胞培養(yǎng)20天后發(fā)現(xiàn)，在2D支架表面，星形膠質(zhì)細胞是附著于培養(yǎng)表面的致密的平坦的單層細胞，只有較少神經(jīng)突生長在相鄰神經(jīng)元的頂部，細胞培養(yǎng)物厚度平均為14.3 μm。而在3D支架上，膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元細胞從未發(fā)現(xiàn)形成分層結(jié)構(gòu)，在空間上存在多個長達40 μm的神經(jīng)突，促細胞分化效果明顯強于2D平面支架。而且通過靜電紡絲制備的3D支架，是未經(jīng)過空間壓縮的連續(xù)三維立體結(jié)構(gòu)，理論上能夠支撐細胞浸潤到整個支架中。

3 紡絲支架在神經(jīng)修復中的應用

3.1 神經(jīng)導管

采用天然或合成材料制備的神經(jīng)導管，能夠最小化軸突分散，防止瘢痕形成并為神經(jīng)修復創(chuàng)造適當?shù)奈h(huán)境[3]。絲素蛋白(SF)是一種用于組織工程的高度生物相容的生物材料，Gu等[29]制備了SF紡絲支架作為神經(jīng)導管進行手術移植，用于評估大鼠周圍神經(jīng)修復的結(jié)果。手術12個月后，絕大多數(shù)導管降解，吸收并被具有神經(jīng)樣外觀的組織取代，而自體移植物組，雖然能夠完全被神經(jīng)樣組織取代，但是間隙兩端神經(jīng)生長不完全，間隙并沒有完全連接修復。通過WalkwayTM步態(tài)分析系統(tǒng)綜合評估狗的后肢運動功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非移植組相比，移植組表現(xiàn)出更好的站立穩(wěn)定性和運動機能，而移植組內(nèi)部對比并沒有顯著性差異。這足以表明SF-支架促使受傷后肢的行為恢復幾乎等同于自體移植物。

施旺細胞是支持周圍神經(jīng)損傷修復和再生的主要細胞，F(xiàn)arzamfar等[30]將接收使用的鋁箔固定在聚丙烯凝固浴底部，獲得了具有海綿狀結(jié)構(gòu)的細胞支架，用于原代施旺細胞培養(yǎng)。細胞接種3天后支架組細胞活力明顯優(yōu)于其他組，具有顯著性差異。第60天結(jié)束時支架組的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)值高于自體移植物和對照組的指數(shù)值。顯然，制備的支架能夠顯著增強損傷神經(jīng)的再生功能，具有一定的適應性。

3.2 調(diào)控細胞因子的釋放

神經(jīng)修復過程中，神經(jīng)細胞因子的表達對治療效果有一定的影響，西酞普蘭治療可以增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達，體內(nèi)研究表明，BDNF可以預防周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)元死亡，并通過激活細胞促進軸突再生，從而增加神經(jīng)纖維的生長和更快的神經(jīng)再生。Naseri-Nosar等[31]以聚乳酸為核心，醋酸纖維素為殼層，通過同軸靜電紡絲技術制備了纖維支架，然后用納米沉淀法將裝有西酞普蘭的明膠納米載體(CGN)涂覆在支架表面，并將支架組裝成神經(jīng)導管植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損處，在手術45天和60天內(nèi)對照組神經(jīng)功能指數(shù)幾乎沒有改善，60天時為-88.06±2.60；而導管組SFI指數(shù)明顯改善，60天時為-34.23±4.15。同時支架組的大鼠體重減輕百分比值(4.18±0.26)%明顯小于未涂層支架(12.59±4.18)%，P<0.05。實驗證明含有西酞普蘭的支架顯著增強了神經(jīng)再生的能力，證明其對神經(jīng)組織工程的適用性。

巨噬細胞通過制備周圍的薄壁組織進行再生，在周圍神經(jīng)損傷后的組織再生中發(fā)揮關鍵作用。白細胞介素10(IL-10)是促進巨噬細胞向抗炎/傷口愈合狀態(tài)的細胞因子。Jason等[32]將IL-10共價結(jié)合到電紡聚己內(nèi)酯納米纖維支架上，將得到的纖維包裹在大鼠的坐骨神經(jīng)周圍，通過精氨酸酶1或CD206雙重標記的M2巨噬細胞證明IL-10綴合的納米纖維成功地誘導巨噬細胞極化朝向支架材料內(nèi)的M2激活狀態(tài)以及神經(jīng)周圍的鄰近組織。同時，植入體內(nèi)后纖維上的IL-10能夠維持長達14天的持續(xù)釋放。

基質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1-α)及其信號受體CXCR4存在于胚胎以及成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的神經(jīng)干細胞(NSCs)，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)生態(tài)位中干細胞歸巢并促進干細胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化。Dai等[33]通過靜電紡絲技術制備了具有不同梯度濃度的細胞衍生因子(SDF-1-α)的膠原蛋白墊。通過接種神經(jīng)干細胞檢測其對具有各種梯度模式纖維墊的反應，實驗結(jié)果表明NSCs對細胞衍生因子較為敏感，并傾向于具有更高SDF-1-α含量的區(qū)域遷移。接種細胞1天后NSCs開始分化，7天后細胞染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著SDF-1-α含量的降低，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞分化減少，再次證明梯度支架可以誘導細胞定向分化。綜上，通過靜電紡絲制備含有細胞因子或者促細胞因子藥物的纖維，能夠促進細胞的生長分化，增強治療效果。

4 展望

通過靜電紡絲法制備的纖維支架不僅對材料的要求較低，而且能夠適用于多種修復手段，能夠廣泛地應用于神經(jīng)修復治療過程中。未來進行優(yōu)化的方向主要分為以下幾個：(1)紡絲材料，通過材料組合或者改性，獲取更有親和力和穩(wěn)定性的材料；(2)空間結(jié)構(gòu)，紡絲的空間結(jié)構(gòu)主要受針頭和收集方式影響，通過針頭改造以及收集方式優(yōu)化獲得與神經(jīng)結(jié)構(gòu)更加相似的紡絲；(3)紡絲產(chǎn)量，提高流速或者多通道同時紡絲以獲得更高的產(chǎn)量。靜電紡絲作為一個交叉學科，就神經(jīng)修復應用方面而言，不僅需要對材料、電場、機械等學科有著深入了解，還要了解神經(jīng)學、細胞學、藥學等多個學科。綜合各學科優(yōu)勢特點，靜電紡絲在神經(jīng)修復領域會有更廣闊的發(fā)展空間。