黃菊陽，王 琴，畢亞男，史 紅，王躍飛，周 昆

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室，天津 300193)

補骨脂為豆科植物補骨脂(PsoraleacorylifoliaL．)的干燥成熟果實，具有溫腎助陽、納氣和止瀉的功效。補骨脂含有多種活性成分，主要成分為補骨脂素和異補骨脂素。補骨脂的應(yīng)用十分廣泛，常用中成藥中含有補骨脂的有30余種。近年來，補骨脂的肝臟毒性引起了廣泛關(guān)注，相繼有臨床和實驗研究報道，其能導(dǎo)致肝臟毒性[1-2]，韓國曾報道了與大量食用補骨脂有關(guān)的急性肝炎病例。另外，部分含有補骨脂的中成藥，如壯骨關(guān)節(jié)丸、白蝕丸也偶見肝毒性報道[3-4]。補骨脂素與異補骨脂素在補骨脂所導(dǎo)致的肝損害中貢獻較大[5-6]，研究表明，異補骨脂素能導(dǎo)致HepG2細胞膽汁酸蓄積，進而產(chǎn)生細胞毒性；腹腔注射異補骨脂素可以引起C57BL/6J小鼠肝損傷[7-8]。以上研究顯示，異補骨脂素在細胞水平及整體動物水平，均能引起肝損傷?；诖?，本研究通過對SD大鼠連續(xù)灌胃異補骨脂素1、3、7 d，進一步驗證異補骨脂素對肝臟的損傷作用，探討異補骨脂素的毒性作用規(guī)律，并且基于膽汁酸轉(zhuǎn)運體，初步探討異補骨脂素肝臟毒性的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠，32只，♀♂各半，體質(zhì)量170～200 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。

1.2藥物與試劑異補骨脂素購自天津市月牙湖科技有限公司，批號201502，其純度經(jīng)HPLC檢測大于98%。黃蓍樹膠粉購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol購自塞默飛世爾科技公司；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase, ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase, AST)試劑盒、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)試劑盒、總膽汁酸(total bile acid, TBA)試劑盒、總膽固醇(total cholesterol, TC)試劑盒、總甘油三脂(total triglyceride, TG)試劑盒、總膽紅素(total bilirubin, TBIL)試劑盒，均由中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)；實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)引物，由上海生工生物工程有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴增試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3儀器Legend Micro17離心機(賽默飛世爾科技公司)；7020全自動生化儀(日本Hitachi公司)；CFX96型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；超聲破碎儀(Vibra-cell processors，美國Sonics公司)。

1.4方法

1.4.1異補骨脂素對大鼠的肝毒性 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機分為對照組(黃蓍樹膠助溶劑組)、異補骨脂素60 mg·kg-1給藥1 d組、3 d組以及7 d組，每組8只，♀♂各半。異補骨脂素用受試藥5%量的黃蓍樹膠助溶，溶解于生理鹽水中。給藥結(jié)束后，所有動物進行麻醉取血、取肝臟，全自動生化儀檢測血清中ALT、AST、ALP、TBA、TC、TG及TBIL的含量，計算肝臟系數(shù)。肝臟系數(shù)= 肝臟重量(g)/ 體質(zhì)量(g)×100%。

1.4.2實時定量PCR 稱取50～70 mg相同位置的肝臟組織，使用眼科剪將組織剪成約1 mm3大小的碎塊，加入TRIzol試劑，運用超聲破碎儀破碎組織后，按照常規(guī)方法提取總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進行反轉(zhuǎn)錄。實時定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA樣本2 μL，上、下游引物各0.4 μL，Top/Tip Green qPCR SuperMix試劑10 μL，無RNA酶水7.2 μL。在94 ℃預(yù)變性4 min，每個循環(huán)94 ℃變性5 s，50～60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共35～40個循環(huán)。取2-△△CT值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。引物序列見Tab 1。

2 結(jié)果

2.1異補骨脂素對大鼠體質(zhì)量的影響如Fig 1所示，給藥前，各組動物體質(zhì)量沒有明顯區(qū)別。給藥后，與對照組相比較，異補骨脂素60 mg·kg-1給藥3 d組的大鼠體質(zhì)量明顯下降。異補骨脂素60 mg·kg-1給藥1 d后，大鼠肝臟重量沒有明顯變化，給藥3 d和7 d后，大鼠肝臟重量明顯增加。異補骨脂素給藥1、3、7 d后，肝臟系數(shù)均明顯升高。

2.2異補骨脂素對大鼠肝臟功能的影響如Tab 2所示，大鼠給予異補骨脂素3 d和7 d后，血清中的ALT均明顯升高。給予異補骨脂素1、3、7 d后，血清中AST的含量明顯增加，ALP的水平在3組中均沒有明顯變化。TBA在異補骨脂素給藥7 d組的大鼠血清中明顯升高，給藥1 d和3 d組中的TC明顯降低。各給藥組中的TG均明顯上升，給藥7 d組的TBIL明顯增加。

Tab 1 Primer sequence of real-time PCR

Fig 1 Effect of isopsoralen on body weight(A), liver weight(B) and liver/body weight ratio(C)after oral administration for 1, 3 or 7

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Tab 2 Effect of isopsoralen on levels of ALT, AST, ALP, TBA, TC, TG and TBIL in rat serumafter oral administration for 1, 3 or 7

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 2 The mRNA levels of BSEP, NTCP, MRP2, MRP4, MDR1, ABCG5, ABCG8 and OSTαin rat liver after oral administration for 1, 3 or 7

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.3異補骨脂素對肝臟主要膽汁酸轉(zhuǎn)運體的影響如Fig 2所示，大鼠給予異補骨脂素3 d和7 d后，肝臟中膽鹽輸出泵(bile salt export pump, BSEP)的mRNA水平明顯下降，異補骨脂素1、3、7 d組中鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)的mRNA水平明顯下降，BSEP、NTCP的mRNA之比也明顯升高。異補骨脂素給藥1 d和7 d后，多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance associated protein 2, MRP2)的mRNA水平明顯下降，異補骨脂素給藥3 d組中MRP2的mRNA水平有下降趨勢，但是差異無顯著性。各組中多藥耐藥相關(guān)蛋白4(multidrug resistance associated protein 4, MRP4)的mRNA水平均沒有明顯變化。異補骨脂素給藥3 d和7 d組中，多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance 1, MDR1)的mRNA水平明顯下降。異補骨脂素給藥1、3、7 d后，三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員5(ATP-binding cassette subfamily G member 5, ABCG5)、ABCG8、有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白α(organic solute transporter alpha, OSTα)的mRNA水平均明顯下降。

3 討論

補骨脂應(yīng)用十分廣泛，歷代中醫(yī)用于治療腎虛、冷瀉、遺滑精、小便頻數(shù)、腰膝冷痛等，外治用于皮膚病、白癜風(fēng)等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補骨脂具有擴張冠脈、抗腫瘤、抗菌、抗抑郁、擬雌激素樣等多種作用[9-12]。然而，補骨脂的肝毒性也被多個研究報道證實，且其毒性成分和致毒機制尚不清楚。異補骨脂素為補骨脂的主要活性成分，其可能與補骨脂引起的肝損害和膽汁淤積有關(guān)。

肝細胞壞死時，由于肝細胞膜破損，細胞內(nèi)的一些酶溢出細胞外，如ALT、AST 等。因此，胞外或血清中ALT和AST的含量能敏感地反映肝細胞損傷與否及損傷程度。在本實驗中，給予異補骨脂素后，血清中ALT和AST的水平持續(xù)明顯升高，尤其是AST，在給予異補骨脂素1 d之后即有明顯的上升，提示異補骨脂素給藥1～7 d均能引起肝損傷。異補骨脂素給藥1 d和3 d后，TC的含量明顯降低；異補骨脂素給藥7 d后，TBA明顯增加。由于膽固醇是合成膽汁酸的原料，該結(jié)果說明異補骨脂素作用后，可能引起了由膽固醇合成膽汁酸增多，從而造成TC含量的下降和TBA含量的升高。異補骨脂素給藥1、3、7 d后，TG的含量均明顯升高，表明異補骨脂素作用后引起肝功能的減退，可能加重機體的脂肪負荷。異補骨脂素給藥7 d后，TBIL的水平也明顯升高，表明異補骨脂素作用7 d，造成肝細胞的受損和肝功能的減退。另外，異補骨脂素作用1 d之后引起肝系數(shù)的明顯升高，并且一直保持高水平。以上研究表明，異補骨脂素作用1 d即引起肝臟的損傷，表現(xiàn)出急性肝臟毒性；作用3 d后，肝臟的損傷進一步加重；作用7 d，肝臟的損傷持續(xù)存在，但是沒有進一步加重的趨勢。而引起肝臟損傷的因素有多種，在本研究中，異補骨脂素的作用能導(dǎo)致膽汁酸水平的升高，最終造成膽汁淤積，損傷肝臟，但是其確切機制還需進一步探討。

研究表明，造成膽汁淤積和肝損傷的原因除與膽汁形成有關(guān)以外，還與膽汁酸的分泌和轉(zhuǎn)運等過程紊亂有關(guān)[13]。膽汁酸在肝臟中合成，通過各級管道最終分泌到十二指腸，進行輔助消化脂肪。而膽汁酸在細胞內(nèi)濃度過高，可導(dǎo)致線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡，從而引起毒性的產(chǎn)生[14]。BSEP 和NTCP是肝細胞膜上兩個重要的膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白，BSEP 將膽汁酸由肝細胞轉(zhuǎn)運至細胞間膽管，NTCP則將膽汁酸從血液轉(zhuǎn)運至肝細胞。這兩種轉(zhuǎn)運蛋白的正常生理功能對于維持血液和肝細胞中的膽汁酸平衡至關(guān)重要。在本研究中，異補骨脂素可以抑制BSEP mRNA的水平，且隨著給藥時間的延長，抑制作用越明顯，具有一定的時間依賴性。同時，異補骨脂素也能降低NTCP mRNA水平，并且該抑制作用呈現(xiàn)時間依賴性地減弱。該數(shù)據(jù)表明，異補骨脂素給藥后，引起B(yǎng)SEP 和NTCP轉(zhuǎn)錄水平的改變，可能對膽汁酸的轉(zhuǎn)運造成影響。而NTCP mRNA水平的降低可能與肝細胞內(nèi)膽汁淤積后，負反饋調(diào)節(jié)NTCP 的轉(zhuǎn)錄，抑制其不斷向肝細胞內(nèi)運輸膽汁酸有關(guān)，這也與之前的文獻報道一致[15]。MRP2、MDR1、ABCG5及ABCG8與BSEP類似，位于肝細胞的頂側(cè)，主要功能是把肝細胞中的膽汁酸轉(zhuǎn)運到微膽管，從而排出肝細胞中過量的膽汁酸。異補骨脂素作用1、3、7 d能抑制MRP2、MDR1、ABCG5、ABCG8的mRNA水平，推測其可能抑制膽汁酸從肝細胞排向膽管。MRP4和OSTα主要功能是把肝細胞中的膽汁酸轉(zhuǎn)運到血液中。異補骨脂素對MRP4 mRNA的水平?jīng)]有影響，但是能夠明顯抑制OSTα mRNA的水平，從而抑制膽汁酸向血液排出。以上研究表明，異補骨脂素給藥1、3、7 d能干擾膽汁酸轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)錄，從而抑制膽汁酸轉(zhuǎn)運體的功能，造成肝臟損傷。而膽汁酸轉(zhuǎn)運體的水平主要受核受體的調(diào)控，法尼醇X受體(farnesoid X receptor, FXR)、孕烷X受體(pregnane X receptor, PXR)等核受體，通過調(diào)控膽汁酸的代謝、外排與轉(zhuǎn)運，從而實現(xiàn)對膽汁酸穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[16]。因此，異補骨脂素是否通過核受體調(diào)控膽汁酸水平，導(dǎo)致肝損傷，將是我們下一步研究要解決的主要問題。

綜上所述，異補骨脂素給藥可造成肝臟的損傷，其機制可能是通過調(diào)控膽汁酸轉(zhuǎn)運體，從而導(dǎo)致肝損傷。