崔昌勝，莊寶祥，吳洪娟，王岱君

(濰坊醫(yī)學(xué)院1. 人體解剖學(xué)教研室、2. 形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261053)

在臨床工作中，移植、斷肢再植、骨筋膜室綜合征等均能引起骨骼肌缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)[1]。IRI包含多個(gè)病理生理過程，例如在炎癥介質(zhì)作用下，可引起全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多器官功能障礙等[2]，威脅患者的生命。因此，防治肢體IRI備受臨床醫(yī)生的關(guān)注。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，脈絡(luò)寧注射液通過影響超氧化物歧化酶、8-異前列腺素F2α、一氧化氮合酶等，減輕骨骼肌IRI，但其保護(hù)作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)擬研究脈絡(luò)寧注射液能否通過影響腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)而發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康♂成年新西蘭白兔30只，由青島康大生物科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)20160002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(魯)20160012。兔齡90 d，體質(zhì)量(2.3±0.2)kg。飼養(yǎng)環(huán)境濕度(50±10)%，溫度(25±1)℃，普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2試劑與儀器脈絡(luò)寧注射液(金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠生產(chǎn)，10 mL/支，生產(chǎn)批號(hào)：20170337)；兔TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒、兔NF-κB ELISA檢測(cè)試劑盒，均購自上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司。TDZ5-WS離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；Bio-Rad 680型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；Hitachi H-7700型透射電鏡(日本Hitachi公司)。

1.3動(dòng)物模型的建立及分組根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將30只動(dòng)物分為3組：對(duì)照組(Control，C)、IRI組(I)、IRI+脈絡(luò)寧(Mailuoning，M)組，每組10只。術(shù)前禁食12 h，左側(cè)耳緣靜脈注射30 g·L-1的戊巴比妥鈉麻醉，給藥劑量30 mg·kg-1。M組及I組動(dòng)物，用氣囊止血帶(長(zhǎng)25 cm，寬2 cm)環(huán)繞右側(cè)后肢根部(膝上約2.5 cm處)，保持氣壓在36～40 kPa，阻斷動(dòng)脈供血及靜脈回流，造成肢體完全缺血。缺血4 h后，將氣囊止血帶松解，恢復(fù)血供以形成再灌注。然后，經(jīng)左側(cè)耳緣靜脈，M組動(dòng)物注射脈絡(luò)寧注射液1.5 mL·kg-1、I組和C組動(dòng)物注射生理鹽水1.5 mL·kg-1。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1TNF-α和NF-κB檢測(cè) 每組動(dòng)物在再灌注2、6、10 h時(shí)，從右側(cè)耳緣靜脈取血液，抗凝、離心、取血漿，用于檢測(cè)TNF-α；從右側(cè)后肢取脛前肌組織，稱重、研磨，制成勻漿后離心、取上清，用于檢測(cè)NF-κB。兩者皆采用ELISA法測(cè)定，按照檢測(cè)試劑盒步驟操作。

1.4.2透射電鏡觀察 從每組中隨機(jī)選擇2只動(dòng)物，在再灌注2、6、10 h時(shí)，取右側(cè)后肢脛前肌組織。將骨骼肌標(biāo)本切成1 mm×1 mm×1 mm大小，戊二醛、鋨酸作前、后固定，梯度乙醇脫水，經(jīng)包埋、超薄切片、撈片、鉛鈾染色等步驟處理，用透射電鏡對(duì)肌組織超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并攝片。

2 結(jié)果

2.1脈絡(luò)寧注射液對(duì)兔肢體IRI血漿中TNF-α濃度的影響Tab 1結(jié)果顯示，同一組內(nèi)比較，對(duì)照組TNF-α濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IRI組和脈絡(luò)寧組TNF-α濃度逐漸升高(P<0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)組間比較，IRI組TNF-α濃度高于對(duì)照組(P<0.01)，脈絡(luò)寧組TNF-α濃度高于對(duì)照組(P<0.01)，但低于IRI組(P<0.05)。

2.2脈絡(luò)寧注射液對(duì)兔肢體IRI肌組織勻漿中NF-κB濃度的影響Tab 2結(jié)果顯示，同一組內(nèi)比較，對(duì)照組或脈絡(luò)寧組各組NF-κB濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IRI組NF-κB濃度逐漸升高(P<0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)組間比較，IRI組NF-κB濃度高于對(duì)照組(P<0.01)，脈絡(luò)寧組NF-κB濃度低于IRI組(P<0.01)，脈絡(luò)寧組與對(duì)照組比較，NF-κB濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 1 Comparison of TNF-α levels

▲P<0.05vs6 h of IRI;△P<0.05vs6 h of Mailuoning;**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsIRI

Tab 2 Comparison of NF-κB levels

▲P<0.05vs6 h of IRI;**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsIRI

2.3脈絡(luò)寧注射液對(duì)兔肢體IRI肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組骨骼肌超微結(jié)構(gòu)正常。IRI組在再灌注2 h時(shí)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，部分線粒體水腫、嵴模糊或消失，部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見顆粒融合或脫顆粒現(xiàn)象；在再灌注6、10 h時(shí)，核周間隙增寬，線粒體空泡樣變、嵴斷裂，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒融合，橫小管粗細(xì)不均，雙側(cè)終池增大。脈絡(luò)寧組2、6、10 h時(shí)可見完整的核仁，核周間隙變化不明顯，線粒體較大、嵴清晰，三聯(lián)體完整，肌纖維接近正常狀態(tài)。

3 討論

骨骼肌IRI過程中存在大量炎性細(xì)胞因子[5]，而NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[6]。炎性細(xì)胞因子一方面可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，另一方面又是NF-κB的刺激劑[7]，可以和IRI產(chǎn)生的氧自由基一起作用于NF-κB的激活。NF-κB可誘導(dǎo)不同炎性靶基因的過度或持續(xù)表達(dá)，經(jīng)趨化、浸潤(rùn)、聚集炎性細(xì)胞，產(chǎn)生炎性效應(yīng)分子，而造成炎癥反應(yīng)[8]。炎性細(xì)胞因子和NF-κB的相互刺激，使炎癥反應(yīng)持續(xù)存在或放大[9]，導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞水腫和損傷。若阻斷兩者的互相激活，可能會(huì)起到減輕炎癥反應(yīng)的作用，進(jìn)而保護(hù)肌細(xì)胞，減輕IRI。

本實(shí)驗(yàn)選取了具有代表性的炎性細(xì)胞因子TNF-α及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NF-κB作為觀測(cè)指標(biāo)。結(jié)果顯示，兔后肢經(jīng)缺血/再灌注處理，血漿TNF-α濃度及肌組織勻漿NF-κB濃度在再灌注2、6、10 h逐漸升高；骨骼肌超微結(jié)構(gòu)與對(duì)照組比較，也出現(xiàn)逐漸加重的損傷改變。經(jīng)脈絡(luò)寧注射液處理，血漿TNF-α濃度及肌組織勻漿NF-κB濃度在再灌注2、6、10 h時(shí)與IRI組同期比較明顯降低，NF-κB濃度與對(duì)照組無明顯差異；骨骼肌超微結(jié)構(gòu)優(yōu)于IRI組，與對(duì)照組差別不大，肌組織形態(tài)基本正常。

綜上所述，脈絡(luò)寧注射液可降低缺血/再灌注后血漿TNF-α和肌組織NF-κB濃度的升高程度，減輕肌細(xì)胞水腫，有利于維持細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的完整性，對(duì)骨骼肌IRI起到保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能是通過阻礙TNF-α與NF-κB的相互激活過程而減輕炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)從蛋白表達(dá)的水平研究了脈絡(luò)寧對(duì)IRI中TNF-α和NF-κB的影響，但未在基因水平上進(jìn)行研究，有待今后進(jìn)一步探討。