鄭 超 綜述，盧忠心 審校

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430014)

醫(yī)學(xué)檢測(cè)的關(guān)鍵在于快速準(zhǔn)確檢測(cè)生物分子，研究建立靈敏度高、特異度好、快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)新方法、新技術(shù)、新裝備對(duì)于疾病的診斷具有重要意義。納米材料科學(xué)技術(shù)和電子技術(shù)的快速發(fā)展助力生物傳感器在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中得以廣泛運(yùn)用，特別是石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器。與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，在核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)菌等的檢測(cè)方面，石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管具備一定的優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在靈敏度高和選擇性高、分析速度快、免標(biāo)記、廉價(jià)、能夠微型化和一體化等[1]，這些優(yōu)點(diǎn)助力石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管在生物分子的床旁化檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。

迄今為止，關(guān)于石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的研究越來(lái)越多。本文簡(jiǎn)要綜述石墨烯器件的制備及工作原理，石墨烯的制備及功能化，重點(diǎn)綜述石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的運(yùn)用，包括核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)菌的檢測(cè)等。

1 石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器制備

1.1石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器結(jié)構(gòu)及工作原理 石墨烯的場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器結(jié)構(gòu)如圖1所示[6]，包括源漏兩極及兩極之間的導(dǎo)電材料石墨烯，基底材料和銀/氯化銀作為柵極，研究者可以在石墨烯上修飾各種生物識(shí)別元件檢測(cè)生物分子。石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的機(jī)理主要有電荷摻雜效應(yīng)和靜電效應(yīng)[2-5]。當(dāng)帶有電荷的生物分子靠近石墨烯表面時(shí)會(huì)影響石墨烯的電荷密度，從而影響石墨烯器件的導(dǎo)電性或者狄拉克點(diǎn)(電導(dǎo)率最低點(diǎn))的偏移，通過電學(xué)信號(hào)的變化對(duì)生物分子進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。

1.2石墨烯的制備 石墨烯的制備方法主要有微機(jī)械剝離法[7]、化學(xué)剝離法[8]、化學(xué)氣相沉積法[9]。

1.2.1微機(jī)械剝離法 即用膠帶對(duì)高定向熱解石墨反復(fù)剝離制備石墨烯，此法稱為“scotch-tape”法。微機(jī)械剝離法制備石墨烯過程復(fù)雜繁瑣，但保證了石墨烯結(jié)構(gòu)的完整和質(zhì)量，更多地被運(yùn)用于石墨烯器件的本征性能研究。但是微機(jī)械剝離法難以控制石墨烯大小、層數(shù)和形狀，并且產(chǎn)量很低，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化制備，限制了其在傳感器中的應(yīng)用。

1.2.2化學(xué)剝離法 在強(qiáng)酸強(qiáng)氧化劑作用下制備石墨烯的方法稱為化學(xué)剝離法，制備得到的石墨烯為氧化石墨烯?；瘜W(xué)剝離法簡(jiǎn)單、廉價(jià)，石墨烯溶液均一穩(wěn)定，并且能大規(guī)模制備。但是由于制備過程對(duì)石墨烯的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了很大的破壞，導(dǎo)致電子遷移率低，往往需要通過化學(xué)還原或者熱還原等方法去除氧化石墨烯上的含氧官能團(tuán)，得到導(dǎo)電性能好的還原氧化石墨烯。

圖1 石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器示意圖及傳感原理圖

1.2.3化學(xué)氣相沉積法(CVD) 即甲烷和氫氣在高溫的作用下可以在金屬(銅、鉑、鎳等)表面催化生長(zhǎng)，該方法可以快速大規(guī)模地制備高質(zhì)量單層石墨烯，但是化學(xué)氣相沉積法需要將生長(zhǎng)在金屬表面的石墨烯轉(zhuǎn)移到相應(yīng)基底上，轉(zhuǎn)移的過程常常涉及到有機(jī)物的使用，因此會(huì)影響到石墨烯本征優(yōu)越性能和后續(xù)生物分子的修飾。

1.3石墨烯的功能化 為了保證傳感器件的靈敏度、特異度和穩(wěn)定性，可以對(duì)石墨烯進(jìn)行功能化修飾?；瘜W(xué)剝離法制備的石墨烯含有大量的含氧官能團(tuán)，如羥基、羧基等，可以利用這些官能團(tuán)共價(jià)修飾生物分子，例如羧基可以與蛋白質(zhì)的氨基或酯基反應(yīng)。共價(jià)結(jié)合方法豐富了生物分子的修飾方法，但石墨烯的本征性能會(huì)受到一定影響。微機(jī)械剝離法和化學(xué)氣相沉積法制備的石墨烯，表面不含有任何官能團(tuán)，為提高傳感器的檢測(cè)性能，同樣可以在石墨烯表面通過共價(jià)或者非共價(jià)的方式修飾生物分子。由于共價(jià)修飾會(huì)在一定程度上影響石墨烯的性能，所以非共價(jià)修飾更多被運(yùn)用于石墨烯的功能化。非共價(jià)修飾的方法主要有范德華力、π-π堆積、靜電吸附等[10-11]。在石墨烯表面固定納米顆粒也是一種被廣泛運(yùn)用的非共價(jià)修飾方法。

2 石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1核酸檢測(cè)

2.1.1DNA傳感器 石墨烯的場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器被廣泛運(yùn)用于核酸的檢測(cè)。DONG等[12]使用多層CVD石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管檢測(cè)DNA，探針DNA通過靜電吸附在石墨烯表面，該器件對(duì)DNA的檢測(cè)限為10 pM，作者也通過在石墨烯表面沉積金納米顆粒來(lái)提高檢測(cè)上限。CHEN等[13]報(bào)道了使用單層CVD石墨烯作為溝道材料，檢測(cè)限比DONG等[12]報(bào)道的低一個(gè)數(shù)量級(jí)，這得益于單層石墨烯更大的體表比。ZHENG等[14]在單層CVD基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用電中性的肽核酸(PNA)代替DNA作為識(shí)別探針，檢測(cè)限進(jìn)一步低至10 fM。

2.1.2miRNA傳感器 miRNA是一類約18～25個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，研究表明miRNA與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，如腫瘤、心血管疾病等。XU等[15]發(fā)明了一種石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管陣列傳感器，并且利用該傳感器特異性檢測(cè)let-7g，通過鏈霉親和素-生物素的放大作用實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大，最低檢測(cè)到了100 fM的靶標(biāo)。CAI等[16]在還原氧化石墨烯表面沉積金納米顆粒，用電中性的PNA代替DNA作為探針分子，金納米顆粒及PNA的使用提高了傳感器對(duì)miRNA的檢測(cè)靈敏度及特異度。

2.2蛋白質(zhì)的檢測(cè)

2.2.1腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè) 腫瘤標(biāo)志物的篩查對(duì)于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診療具有重要意義，因此研究簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、有效的方法、技術(shù)，對(duì)于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)非常重要。石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管在腫瘤標(biāo)志物的篩查中具有一定優(yōu)勢(shì)。KIM等[17]將前列腺特異性抗原(PSA)抗體固定在還原氧化石墨烯表面檢測(cè)前列腺癌標(biāo)志物——前列腺特異性抗原-抗糜蛋白酶復(fù)合物(PSA-ACT)，當(dāng)PSA抗體結(jié)合PSA-ACT后，狄拉克點(diǎn)發(fā)生偏移，根據(jù)狄拉克點(diǎn)偏移多少進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限低至飛摩爾，檢測(cè)范圍跨越6個(gè)數(shù)量級(jí)。MYUNG等[18]為了提高傳感器的檢測(cè)靈敏度，將二氧化硅納米顆粒(NPs)包裹石墨烯檢測(cè)乳腺癌標(biāo)志物——人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，NPs經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)處理后表面有帶正電的氨基，可以與帶負(fù)電的氧化石墨烯(GO)靜電結(jié)合形成GO-NPs，化學(xué)還原后形成rGO-NPs。HER2和EGFR抗體被固定在rGO-NPs，該傳感器對(duì)HER2和EGFR的檢測(cè)限分別為1 pM和100 pM，并且在高濃度的蛋白質(zhì)干擾下也能檢測(cè)到低濃度的靶標(biāo)，具有很高的特異度。ZHOU等[19]也使用石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)，傳感器的電流變化越大，CEA的濃度越高，通過電流的變化大小可對(duì)CEA進(jìn)行定量檢測(cè)。同樣，最近MANOSOURI等[20]使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)作為柔性基底和羧基化的多壁碳納米管/還原氧化石墨烯作為溝道材料構(gòu)件場(chǎng)效應(yīng)晶體管，然后將CA125適配體修飾在溝道上，該適配體傳感器檢測(cè)范圍寬(1.0×10-9～1.0 U/mL)，檢測(cè)限低(5.0×10-10U/mL)。

2.2.2心血管疾病標(biāo)志物檢測(cè) 腦鈉肽(BNP)是心力衰竭的重要標(biāo)志物，LEI等[21]將鉑納米顆粒沉積在石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管上，然后將BNP抗體修飾在納米鉑顆粒上，提高傳感器的檢測(cè)靈敏度，該傳感器結(jié)合微濾系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)全血中BNP的高靈敏度、高特異度檢測(cè)，靈敏度達(dá)100 fM，其他蛋白質(zhì)對(duì)BNP的檢測(cè)幾乎沒有影響，該傳感器有望運(yùn)用于臨床檢測(cè)。WANG等[22]采用微加工工藝實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；苽湮⒚准?jí)別的CVD石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管，并將凝血酶適配體通過1-芘丁酸-琥珀酰亞胺酯(PASE)連接劑修飾在石墨烯表面，通過電流的變化實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)檢測(cè)凝血酶，并且研究了凝血酶適配體與凝血酶的相互作用的情況。

2.2.3免疫球蛋白定量 免疫球蛋白E(IgE)和G(IgG)是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它們與過敏、感染、腫瘤等密切相關(guān)。OHNO等[23]將IgE適配子修飾在石墨烯表面檢測(cè)IgE，IgE的適配子的使用可以增強(qiáng)與IgE的作用和降低反應(yīng)體系的德拜長(zhǎng)度，降低檢測(cè)限，因此該傳感器最低能檢測(cè)到0.29 nM的IgE。MAO等[24]在還原氧化石墨烯表面修飾金納米顆粒提高檢測(cè)靈敏度，抗IgG抗體固定在金顆粒表面檢測(cè)IgG，該傳感器的檢測(cè)限為0.2 ng/mL。

2.3細(xì)菌的檢測(cè) 快速、正確鑒定細(xì)菌對(duì)于疾病的診斷和治療也非常重要。石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管在細(xì)菌的檢測(cè)中同樣具有很大的優(yōu)勢(shì)與前景。MOHANTY等[25]將化學(xué)修飾的石墨烯與細(xì)菌整合構(gòu)建器件，當(dāng)帶負(fù)電荷的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌(蠟樣芽孢桿菌)靜電吸附在帶正電荷的石墨烯上時(shí)，石墨烯的電導(dǎo)率增大，通過電導(dǎo)率的變化來(lái)檢測(cè)細(xì)菌，遺憾的是靜電吸附的方式導(dǎo)致了該法特異度不高。HUANG等[3]報(bào)道了一種高靈敏檢測(cè)細(xì)菌的傳感器，在CVD石墨烯表面修飾大腸桿菌抗體，當(dāng)加入的大腸桿菌濃度越大時(shí)，電導(dǎo)率變化也越大，檢測(cè)靈敏度達(dá)10 cfu/mL，其他細(xì)菌也沒有對(duì)信號(hào)產(chǎn)生干擾，特異度很高，該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步運(yùn)用該傳感器進(jìn)行抗菌藥物的篩選。最近，CHANG等[26]報(bào)道了利用超聲輔助自組裝氧化石墨烯構(gòu)建傳感器，金納米顆粒被濺射在石墨烯表面，后將大腸桿菌抗體固定在金納米顆粒表面，靈敏度同樣也是10 cfu/mL，雖然靈敏度沒有提高，但是這種方法更加簡(jiǎn)單、廉價(jià)，可以大規(guī)模運(yùn)用。

2.4其他 外傷患者動(dòng)脈血中乳酸的水平與病死率有很大關(guān)聯(lián)，及時(shí)檢測(cè)患者血中的乳酸水平對(duì)降低患者病死率具有重要意義。LABROO等[27]將石墨烯轉(zhuǎn)移到柔性基底PET上，后將乳酸氧化酶修飾在石墨烯表面檢測(cè)血中的乳酸水平，傳感器檢測(cè)線性范圍為0.08 M～20 M。HUANG等[28]在石墨烯表面修飾修飾葡萄糖氧化酶和谷氨酸脫氫酶檢測(cè)葡萄糖和谷氨酸，檢測(cè)限分別為0.1 mM和5 mM。

3 結(jié) 論

本文簡(jiǎn)要綜述了石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管的結(jié)構(gòu)及工作原理、石墨烯的制備方法、石墨烯的功能化方法及石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的研究進(jìn)展。石墨烯的優(yōu)越電學(xué)性能，對(duì)于構(gòu)建快速、靈敏、廉價(jià)的場(chǎng)效應(yīng)晶體管檢測(cè)系統(tǒng)提供了巨大的優(yōu)勢(shì)，石墨烯制備技術(shù)的快速發(fā)展更是為制備性能優(yōu)越的石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器提供了保障。石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)目前還處于剛剛興起的階段，轉(zhuǎn)化為商業(yè)診斷器材仍然存在一些問題:(1)對(duì)實(shí)際樣本的檢測(cè)能力不夠，生物傳感器對(duì)于血液或者體液中的復(fù)雜物質(zhì)抗干擾能力較差；(2)德拜長(zhǎng)度和溝道材料石墨烯有限的面積限制了石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管具備更高靈敏度；(3)如何規(guī)?；苽湫阅芫环€(wěn)定的廉價(jià)石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管及陣列仍然具有很大挑戰(zhàn)。需要解決以上問題可能需要從以下幾個(gè)方面入手：(1)研究石墨烯功能化的新方法和發(fā)現(xiàn)更多的生物識(shí)別元件，提高傳感器檢測(cè)靈敏度、特異度及對(duì)實(shí)際樣本的檢測(cè)能力；(2)研究大規(guī)模制備低價(jià)高質(zhì)量石墨烯的方法，尋找廉價(jià)且不影響器件本身性質(zhì)的基底。相信在更多研究人員的努力下，石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管能夠在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中扮演越來(lái)越重要的角色。