聶黎行，戴忠，馬雙成

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

牛黃清心丸(局方)由牛黃、當(dāng)歸、川芎、甘草、山藥、黃芩、炒苦杏仁、大豆黃卷、大棗、炒白術(shù)、茯苓、桔梗、防風(fēng)、柴胡、阿膠、干姜、白芍、人參、六神曲(炒)、肉桂、麥冬、白蘞、蒲黃(炒)、人工麝香、冰片、水牛角濃縮粉、羚羊角、朱砂、雄黃等29味中藥材粉碎配研制成，具有清心化痰、鎮(zhèn)驚祛風(fēng)的功效，用于風(fēng)痰阻竅所致的頭暈?zāi)垦！⑻迪眼帐?、神志混亂、言語不清及驚風(fēng)抽搐、癲[1]。方中冰片起開竅醒神的作用，為合成品，主要成分為龍腦，合成過程可產(chǎn)生副產(chǎn)物異龍腦和樟腦，后者內(nèi)服可致中毒[2]。冰片與樟腦，外形相似，氣味相近，因其與樟腦的價格差異，市場上存在冰片樣品摻入樟腦的問題[3-4]，但口服藥品中樟腦的安全控制尚未引起重視，有關(guān)中成藥中樟腦限量檢查的研究報道較少[5-6]。氣相色譜法具有簡便、準(zhǔn)確、快速、靈敏等優(yōu)點，已被廣泛用于中藥的質(zhì)量控制[7-9]，筆者采用氣相色譜法建立牛黃清心丸(局方)中樟腦的限量檢查方法，為該類藥品的安全性評價提供了實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Mettler AE240電子天平(梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.01 mg)、Mettler FX-200電子天平(梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.1 mg)，KQ3200DB 型數(shù)控超聲波清洗器，Agilent 7890N氣相色譜儀。

1.2藥品與試劑 樟腦對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110747-201008)。牛黃清心丸(局方)(9個廠家，38批次，均為2014年國家藥品監(jiān)督抽驗樣品)。冰片、牛黃、當(dāng)歸、川芎、甘草、山藥、黃芩、炒苦杏仁、大豆黃卷、大棗、炒白術(shù)、茯苓、桔梗、防風(fēng)、柴胡、阿膠、干姜、白芍、人參、六神曲(炒)、肉桂、麥冬、白蘞、蒲黃(炒)、人工麝香、水牛角濃縮粉、羚羊角、朱砂、雄黃等原料藥材由被檢驗制藥企業(yè)提供。硅藻土、分析純無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯和丙酮購于北京化學(xué)試劑公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：HP-INNOWAX毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm ×30 m，0.25 μm)，柱溫：110 ℃；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；FID檢測器溫度：230 ℃；載氣：氮氣，流速：1.8 mL·min-1，分流比10：1 ；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取樟腦對照品10 mg，置于100 mL量瓶，加無水乙醇溶解并定容，搖勻。精密量取上述溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加無水乙醇定容，制成每毫升含樟腦2 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取本品重量差異項下的大蜜丸，剪碎，混勻，取約3.0 g，精密稱定，再加入硅藻土2.0 g，研勻，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇15 mL，密塞，稱定質(zhì)量，冰浴超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用無水乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液的制備 取經(jīng)檢驗不含樟腦的冰片和其余原料藥材，按處方和制法制得缺樟腦陰性對照，按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3方法學(xué)驗證

2.3.1專屬性實驗 分別取對照品溶液、供試品溶液與缺樟腦陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，牛黃清心丸(局方)在樟腦的保留時間處，無其他成分干擾，見圖1。

2.3.2線性關(guān)系、檢出限和定量限 精密稱取對照品適量，制得系列濃度對照品溶液，進(jìn)樣測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果回歸方程為Y=3.15X+4.22，r=0.998 9。樟腦在1.65～165 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好，精密量取對照品溶液適量，稀釋至不同濃度，進(jìn)樣測定，測得檢出限(信噪比3：1)為0.42 μg·mL-1，定量限(信噪比10：1)為1.60 μg·mL-1。

2.3.3精密度實驗 精密吸取對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定樟腦峰面積，計算RSD值為0.52%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液(編號：8434)，按“2.1”項下色譜條件，分別在0，1，2，4，8 h進(jìn)樣，測定樟腦峰面積，計算RSD值為0.57%(n= 6)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.樟腦

圖1缺樟腦陰性樣品(A)、樟腦對照品(B)、牛黃清心丸(局方)(C)的GC色譜圖

1.camphor

Fig.1GCchromatogramsofnegativesamplewithoutcamphor(A)，camphorreferencestandard(B)andNiuhuangqingxinpills(prescriptionofthebureau) (C)

2.3.5重復(fù)性實驗 取同一批號樣品(編號：8434)，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備6份樣品，按“2.1”項下色譜條件，測得樟腦含量的平均值為0.002%，RSD值為1.75%(n= 6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6回收率實驗 取已知含量的樣品(編號：8434)，剪碎，混勻，稱取約1.5 g，再加入硅藻土1.0 g，研勻，置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.03 mg·mL-1的樟腦對照品溶液各0.5，1.0，1.5 mL，再分別精密加入無水乙醇14.5，14.0，13.5 mL，從“密塞”起，按照“2.2.2”項下方法制備9份加樣回收溶液(每個加樣濃度制備3份)，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 樟腦加樣回收實驗結(jié)果

2.3.7樣品測定結(jié)果 取9個廠家生產(chǎn)的牛黃清心丸(局方)38批次，依法測定，結(jié)果見表2。所有樣品測定值趨于靠近0的偏態(tài)分布，頻數(shù)分布圖見圖2，有6個廠家7批次樣品檢出微量樟腦，不同生產(chǎn)企業(yè)樣品樟腦測定值箱式比較見圖3。

表2 牛黃清心丸(局方)中樟腦含量

圖2牛黃清心丸(局方)中樟腦測定值頻數(shù)分布圖

Fig.2FrequencydistributionplotofcamphorcontentinNiuhuangqingxinpills(prescriptionofthebureau)

3 討論

筆者對提取方法進(jìn)行優(yōu)化，比較加入硅藻土和不同有機溶劑對提取效率的影響，結(jié)果顯示加入硅藻土研磨有助于成分的溶出，無水乙醇提取效率高于正己烷、乙酸乙酯和丙酮。

《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定冰片“含樟腦不得超過0.50%”，按冰片藥材每日最大服用量計算，樟腦的每日最大攝入量為1.5 mg，牛黃清心丸(局方)的用量為一次一丸(袋)，一日一次，每天最大服用劑量為3 g，故本品樟腦的擬定安全限度為0.050%，測定值均低于上述限度。研究還對牛黃清心丸(局方)中龍腦、異龍腦的含量行了測定，并計算樟腦在3種成分含量總和中所占比例，結(jié)果檢出樟腦的樣品，樟腦占總量的比例均大于冰片藥材的限量0.50%，提示制藥企業(yè)應(yīng)嚴(yán)格控制冰片原料質(zhì)量。

圖3不同生產(chǎn)企業(yè)牛黃清心丸(局方)中樟腦測定值箱式比較圖

Fig.3BoxplotofcamphorcontentinNiuhuangqingxinpills(prescriptionofthebureau)fromdifferentmanufactures