羅才奎，涂勤，余小祥，孟亮，樊文，陶亮

[武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院(武漢市第三醫(yī)院)神經(jīng)外科，武漢 430060]

腦轉(zhuǎn)移癌是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，多指原發(fā)于身體其他部位的腫瘤通過某種途徑轉(zhuǎn)移到顱內(nèi)，并形成新的病灶，轉(zhuǎn)移癌占顱內(nèi)腫瘤約10%，20%～40%癌癥患者有顱內(nèi)轉(zhuǎn)移，發(fā)生年齡與全身腫瘤相同，以40～60歲多見。腫瘤細(xì)胞可經(jīng)多種途徑轉(zhuǎn)移到顱內(nèi)，其中以經(jīng)血流途徑轉(zhuǎn)移最為常見，如肺癌主要經(jīng)血流轉(zhuǎn)移，易在顱內(nèi)形成多發(fā)轉(zhuǎn)移瘤。腦轉(zhuǎn)移癌治療可采用手術(shù)治療，但轉(zhuǎn)移瘤存在多發(fā)性，有時(shí)手術(shù)無法完全切除，盡管術(shù)后可輔助放射治療(放療)、化學(xué)治療(化療)，但患者仍存在復(fù)發(fā)率高、生存期短、5年生存率低等問題，導(dǎo)致其臨床治療效果不佳。雙硫侖(disulfiram，DSF)也叫戒酒硫，是一種傳統(tǒng)的戒酒藥物，近年來有研究人員研究發(fā)現(xiàn)，雙硫侖聯(lián)合銅(DSF/Cu)還有抑制腫瘤的作用，能夠殺傷包括黑色素瘤、直腸癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞[1-3]。筆者在本研究旨在探討DSF/Cu對(duì)肺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試藥 DSF(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1110071)、銅鹽(選用CuSO4/Cu2+)(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：20160302)，肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞(我院患者手術(shù)切除的標(biāo)本)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8( CCK-8) (Dojindo公司，批號(hào)：BB18011X)，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)基(批號(hào)：L401003)、小牛血清(FBS，批號(hào)：20170205)、二甲亞砜(DMSO，Sigma公司，批號(hào)：D0798)，細(xì)胞凋亡試劑盒(批號(hào)：20170408)、丙戊酸鈉 (VPA，批號(hào)：20160509)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2儀器 流式細(xì)胞儀(Beckman公司，型號(hào)：FC500)，高速離心機(jī)(型號(hào)：3300，日本 Kubota公司)，紫外-可見分光光度計(jì)(Beckman公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌手術(shù)后的新鮮離體標(biāo)本，一部分送常規(guī)病理檢查，剩余大小約1 cm×1 cm×1 cm的組織無菌包裹，送入無菌培養(yǎng)間培養(yǎng)。蘇木精-伊紅(HE)及免疫組化檢查證明為肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌的標(biāo)本繼續(xù)培養(yǎng)。標(biāo)本的處理應(yīng)用機(jī)械分散法分離細(xì)胞。用剪刀將瘤組織剪成碎塊，并將組織碎塊放在注射器內(nèi)，反復(fù)推壓后取出，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液。鏡檢細(xì)胞計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)。用上述分離方法得到的細(xì)胞，細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)1×106·mL-1，肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞培養(yǎng)及分組細(xì)胞置于含10%FBS和100 U·mL-1青霉素-100 mg·mL-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、相對(duì)濕度95%，24 h更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞覆蓋瓶底>95%則用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞懸浮于含有10%DMSO、30%FBS和60%DMEM/F12的培養(yǎng)基中，保存在液態(tài)氮中備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(不予任何藥物)、VPA組(VPA 1.0 mmol·L-1)、DSF/Cu組(1，2，3，4，5 mg/0.17 mg)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將空白對(duì)照組、VPA組作為陰性對(duì)照。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)DSF/Cu對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞增殖的影響 取備用細(xì)胞，解凍后置于上述培養(yǎng)基中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，按5.0×104·mL-1種于96孔板中，孵育24 h，棄去舊的培養(yǎng)液，加入含F(xiàn)BS的新鮮培養(yǎng)液，每孔200 μL，再按上述分組分別加入相應(yīng)濃度的藥物，均培養(yǎng)72 h。棄去培養(yǎng)液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值7.4，每孔100 μL)和CCK-8溶液(每孔10 μL)，于37 ℃避光孵化1 h，經(jīng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)480 nm檢測(cè)每組各孔吸光度(A值)，依照公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率(%)=(1-試驗(yàn)孔A值)/對(duì)照孔A值×100%。

1.2.3Transwell小室檢測(cè)DSF/Cu對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞遷移的影響 用不含血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整各組細(xì)胞密度為2.0×105·mL-1，上室加細(xì)胞懸液100 μL，下室加DMEM培養(yǎng)液(預(yù)先加10%FBS)600 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，24 h后棄上室培養(yǎng)液，取無水甲醇800μL室溫固定30 min，棉簽輕輕拭去底膜上室側(cè)的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，取底膜下室側(cè)左、右、中、上、下5處高倍視野(×400)的細(xì)胞總數(shù)，重復(fù)3次，并取平均值。

1.2.4Annexin V-PI雙染色法檢測(cè)DSF/Cu對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞凋亡的影響 按試劑盒說明書操作，用不含EDTA的胰蛋白酶(0.25%)消化并收集各組細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，緩沖液懸浮并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106·mL-1，流式管加入細(xì)胞懸液100 μL，分別加入Annexin V 10 μL和碘化丙啶(PI)5 μL，混勻，常溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Ex=488 nm，Em=530 nm，計(jì)算總凋亡率。

2 結(jié)果

2.1CCK-8法檢測(cè)DSF/Cu對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞增殖的影響 隨著DSF/Cu藥物劑量不斷增加，其對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞增殖的抑制率明顯加強(qiáng)，1 mg/0.17 mg組(29.68±3.12)%，2 mg/0.17 mg組(39.35±4.37)%，3 mg/0.17 mg組(58.84±5.15)%，4 mg/0.17 mg組(60.54±4.24)%，5 mg/0.17 mg組(81.21±6.36)%，空白對(duì)照組 (7.10±5.12)%，VPA組 (8.13±4.10)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而且DSF/Cu對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞增殖的抑制率與藥物劑量呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2Transwell小室檢測(cè)DSF/Cu對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞遷移的影響 DSF/Cu藥物處理肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞72 h后，各劑量組肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的遷移能力受到明顯的抑制(P<0.05或P<0.01)，而且DSF/Cu藥物對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞遷移的抑制能力具藥物劑量依賴性，其中空白對(duì)照組遷移(42.3±1.6)個(gè)，VPA組(32.1±1.2)個(gè)，DSF/Cu1 mg/0.17 mg組(19.1±1.1)個(gè)，2 mg/0.17 mg組(11.5±1.8)個(gè)，3 mg/0.17 mg組(8.5±1.3)個(gè)，4 mg/0.17 mg組(6.3±1.3)個(gè)，5 mg/0.17 mg組 (3.3±1.6)個(gè)。見圖1。

2.3Annexin V-PI雙染色法檢測(cè)DSF/Cu對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞凋亡的影響 各劑量的DSF/Cu藥物處理后肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的凋亡率明顯增加，VPA組(8.42±2.15)%，DSF/Cu 1 mg/0.17 mg組(11.24±1.34)%，2 mg/0.17 mg組(17.25±1.83)%，3 mg/0.17 mg組(25.67±1.66)%，4 mg/0.17 mg組(31.29±1.19)%，5 mg/0.17 mg組(45.12±1.13)%，與空白對(duì)照組 (6.98±1.31)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

3 討論

雙硫侖是一種傳統(tǒng)的戒酒藥物[9]，服用后即使飲用少量的酒，身體也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重不適，而達(dá)到戒酒的目的。雙硫侖安全，高效，毒性低，近年來有研究人員發(fā)現(xiàn)其有著廣泛的抗腫瘤的作用，能夠?qū)Πǚ伟⑷橄侔?、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、伯基特淋巴瘤等在內(nèi)的多種腫瘤起到抑制和殺傷作用[10-12]。SKROTT等[13]研究表明雙硫侖具有抗癌活性，并首次確定雙硫侖的抑制癌癥的具體機(jī)制：只有正常結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)才能發(fā)揮其作用，如果細(xì)胞在合成蛋白質(zhì)的過程中出現(xiàn)錯(cuò)誤的表達(dá)以及其空間結(jié)構(gòu)異常，細(xì)胞內(nèi)的泛素蛋白酶系統(tǒng)，p97-NPL4通路就會(huì)激活，將異常的蛋白質(zhì)降解，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。而癌細(xì)胞比正常細(xì)胞增殖周期、蛋白合成更快，出現(xiàn)異常蛋白質(zhì)概率也越大[14]，所以癌細(xì)胞的存活更加依賴P97-NPL4通路對(duì)合成蛋白質(zhì)的調(diào)控，故此激活通路與多種癌癥的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15-16]。在體內(nèi)癌細(xì)胞會(huì)比正常細(xì)胞產(chǎn)生更多的銅離子[17]，而且雙硫侖的代謝產(chǎn)物具有對(duì)癌細(xì)胞的特殊靶向性，會(huì)更多集中在癌細(xì)胞中與銅離子結(jié)合形成抗癌復(fù)合物，而這種活性復(fù)合物又與p97-NPL4通路中的NPL4蛋白結(jié)合，抑制其降解異常蛋白質(zhì)的功能，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)功能異常蛋白的積累，最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[13]。

從本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以看出，DSF/Cu對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的增殖及遷移起到抑制作用，同時(shí)能促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。由于癌細(xì)胞比正常細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更多銅離子，以及雙硫侖對(duì)癌細(xì)胞的靶向性，可以推論出雙硫侖對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞有靶向抑制作用，其作用機(jī)制亦可能與癌細(xì)胞p97-NPL4通路被雙硫侖抑制，導(dǎo)致肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞因細(xì)胞內(nèi)功能異常蛋白質(zhì)積累而凋亡有關(guān)。腦轉(zhuǎn)移癌患者手術(shù)后需輔助放化療，費(fèi)用高，副作用大，患者痛苦不易接受，有些患者腦轉(zhuǎn)移癌病灶較多無法完全手術(shù)切除，或者無法手術(shù)，亦或術(shù)后復(fù)發(fā)，既然本實(shí)驗(yàn)雙硫侖對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞有抑制作用，那么雙硫侖對(duì)其他類型的腦轉(zhuǎn)移癌是否也有一定的抗癌作用？具有一定的研究意義，將進(jìn)一步研究雙硫侖這種古老而且廉價(jià)的戒酒藥抑制腦轉(zhuǎn)移癌的抗癌機(jī)制，為其臨床應(yīng)用治療腦轉(zhuǎn)移癌提供更充足的理論依據(jù)，雙硫侖有望成為聯(lián)合治療腦轉(zhuǎn)移癌的新手段。

A.空白對(duì)照組；B.VPA組；C. 1 mg/0.17 mg組；D. 2 mg/0.17 mg組；E. 3 mg/0.17 mg組；F. 4 mg/0.17 mg組；G.5 mg/0.17 mg組

圖1DSF/Cu對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞遷移的影響

A.blank control group；B.VPA group；C. 1 mg/0.17 mg group；D.2 mg/0.17 mg group；E. 3 mg/0.17 mg group；F. 4 mg/0.17 mg group；G. 5 mg/0.17 mg group

Fig.1EffectofDSF/Cuonmigrationofbrainmetastasesfromlungcancer

A.空白對(duì)照組；B.VPA組；C. 1 mg/0.17 mg組；D. 2 mg/0.17 mg組；E. 3 mg/0.17 mg組；F. 4 mg/0.17 mg組；G.5 mg/0.17 mg組

圖2DSF/Cu對(duì)肺腺癌腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞凋亡的影響

A.blank control group；B.VPA group；C. 1 mg/0.17 mg group；D.2 mg/0.17 mg group；E. 3 mg/0.17 mg group；F. 4 mg/0.17 mg group；G. 5 mg/0.17 mg group

Fig.2EffectofDSF/Cuonapoptosisofbrainmetastasesfromlungcancer