張 悅 趙 鑫 侯 崢 王艷敏,2 王玉成 王 超*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱 150081)

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是植物代謝中的一個關(guān)鍵酶，它催化甲硫氨酸與ATP生物合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAM是生物體中重要的代謝物質(zhì)，參與了植物的轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)硫反應(yīng)等多種生理過程[1～3]。SAM作為重要的甲基供體，為核酸、蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等提供甲基化修[4]。SAM具有轉(zhuǎn)氨丙基功能，在多胺(精胺、亞精胺等)合成途徑中發(fā)揮重要作用[5]。此外，SAM還參與乙烯、谷胱甘肽、甜菜堿以及木質(zhì)素的合成和代謝過程[6～8]。因此，SAMS基因在植物生長發(fā)育、新陳代謝及逆境脅迫響應(yīng)過程中都發(fā)揮重要作用。

目前，SAMS基因已在擬南芥[9]、小麥[10]、玉米[11]、楊樹[12]、松樹[13]等多種植物中被克隆，并且發(fā)現(xiàn)在一些植物中SAMS基因家族具有多個成員，擬南芥中有4個SAMS成員、玉米中4個、番茄中有3個[14]、煙草中至少有2個[15]。在擬南芥基因SAMS家族4個成員中，SAMS1、SAMS2和SAMS4在所有組織中均有表達(dá)，而SAMS3主要在花粉中表達(dá)[16～17]。玉米SAMS基因家族4個成員根莖中的表達(dá)量大于葉片，其中SAMS1、SAMS2和SAMS4的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，而SAMS3不受鹽脅迫誘導(dǎo)[11]。松樹PcSAMS1優(yōu)先在根中表達(dá)，并且在不定根分生組織中特異性表達(dá)，而PcSAMS2在根和芽中表達(dá)并且在不定根形成期間表達(dá)下調(diào)[13]?？梢姡m然植物SAMS基因序列具有較高的相似性，但不同植物SAMS基因或同一物種的不同家族成員之間的表達(dá)模式具有明顯的組織和時間特異性[16～18]，表明不同的SAMS基因可能參與了不同的生理代謝過程。因此，克隆不同物種的SAMS基因，對進(jìn)一步了解該基因的功能具有重要意義。

剛毛檉柳(Tamarixhispida)是一種生長在干旱沙漠中的樹種，能吸收到深層的地下水，并且能在含鹽0.5%～1%的鹽堿地上生長，具有很強(qiáng)的抗干旱和抗鹽堿能力，表明其體內(nèi)存在大量具有抗逆功能的基因資源，是研究木本植物抗逆機(jī)制和篩選及分離抗逆基因的理想材料[19]。但是，目前為止關(guān)于剛毛檉柳SAMS基因結(jié)構(gòu)和功能的研究未見報道。本研究克隆了一條編碼剛毛檉柳SAMS基因ThSAMS全長cDNA序列，對該序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，利用qRT-PCR技術(shù)分析其在NaCl、PEG和外源ABA脅迫下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究ThSAMS在剛毛檉柳非生物脅迫應(yīng)答中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理方法

將采自中國科學(xué)院吐魯番沙漠植物園的剛毛檉柳種子播種于V(泥炭土)∶V(沙)為1∶3的混合土中，放置于溫室培養(yǎng)，溫室培養(yǎng)條件為：平均溫度24℃，相對濕度70%～75%，光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h/8 h。選取生長狀態(tài)良好和長勢相同的2月齡剛毛檉柳幼苗對其進(jìn)行處理，分別用0.4 mol·L-1NaCl、20%(w/v)PEG6000和和100 μmol·L-1ABA澆灌檉柳幼苗，在脅迫處理1、2、6、12、24、48 h后，分別取剛毛檉柳的根部組織和地上部分組織，每個時間點同時用正常澆水幼苗作為對照，每個處理重復(fù)3次，每個樣品至少15棵幼苗，使其充分混合后用液氮速凍，置于-80℃冰箱用于提取RNA。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

用CTAB法提取不同脅迫處理的剛毛檉柳地上和地下組織總RNA，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。

1.3 ThSASM全長cDNA序列克隆

根據(jù)剛毛檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中Unigenes功能注釋結(jié)果，查找并獲得一條SAMS基因的序列。為了驗證基因序列的準(zhǔn)確性，利用primer premier 5.0設(shè)計引物，上游引物P1序列為TGCTGGTGACCAAGGTCACATGTTTGGCTAC，下游引物P2序列為GGTGGTGCTTTCTCCGGAAAGGAC，以檉柳cDNA為模板對該基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的條帶進(jìn)行膠回收純化后，連接到pMD18-T載體上進(jìn)行測序。獲得ThSASM基因全長序列。

1.4 ThSASM基因及蛋白的生物信息學(xué)分析

利用在線工具ORF founder分析ThSAMS基因的開放讀碼框(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)；利用ExPASy在線軟件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測ThSAMS編碼的氨基酸序列的分子量及理論等電點；用二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測ThSAMS基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；用Protscale在線分析ThSAMS蛋白質(zhì)的疏水性(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)；用PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(https://www.genscript.com/psort.html)。通過NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站進(jìn)行BlastP檢索，獲得與剛毛檉柳ThSAMS基因同源性較高的10種植物的SAMS基因蛋白序列，利用BioEdit軟件進(jìn)行多序列比對，對其進(jìn)行蛋白序列保守結(jié)構(gòu)分析，并利用MEGA6.0軟件預(yù)測系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 ThSASM基因表達(dá)分析

利用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)對ThSASM基因的表達(dá)進(jìn)行分析。根據(jù)ThSAMS全長cDNA序列設(shè)計定量引物(表1)，以剛毛檉柳β-actin(FJ618517)、α-tubulin(FJ618518)和β-tubulin(FJ618519)基因作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。利用MJ Opticon實時定量PCR儀(Bio-Rad，Hercules，CA)分析ThSAMS基因的表達(dá)模式。實時熒光定量RT-PCR使用全式金的TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒，反應(yīng)體系為：2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，稀釋10倍后的模板cDNA 2 μL，上游引物和下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，加滅菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性12 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，79℃讀板1 s，45個循環(huán)。待PCR反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溫度以0.5℃·s-1的速度從55℃升到99℃。每個樣品重復(fù)3次，用2-△△Ct方法進(jìn)行基因的相對定量分析[20～21]。

表1 實時定量RT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 ThSAMS基因全長cDNA的獲得

通過分析剛毛檉柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計全長序列的上、下游引物P1和P2，經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳分離后呈現(xiàn)一條長約1 185 bp的特異性條帶(圖1)。與預(yù)期片段大小一致。將該序列膠回收后連接至pMD18-T上，基因測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組堿基完全相同，將此基因命名為ThSAMS。

圖1 檉柳ThSAMS基因的克隆Fig.1 Cloning of ThSAMS gene from T.hispida

2.2 ThSAMS基因的生物信息學(xué)分析2.2.1 ThSAMS氨基酸組成、理化性質(zhì)分析

運(yùn)用ORF Finder和ExPASy進(jìn)行分析，得知ThSAMS基因cDNA全長(ORF)為1 185 bp，編碼394個氨基酸序列(圖2A)。ThSAMS基因編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為97.85 kDa；理論等電點PI為5.02，推測其分子式為C3529H5875N1185O1478S290。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)估算值為47.75，為不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。理論推導(dǎo)出半衰期大約為4.4 h；親水性平均數(shù)為0.765，預(yù)測該蛋白為親水性蛋白，與Protscale在線分析ThSAMS蛋白質(zhì)的疏水性結(jié)果一致(圖3B)。利用NCBI CD-Search service工具對ThSAMS編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明，ThSAMS基因序列氨基酸區(qū)域含有S-AdoMet_synt_C超級家族核心序列(圖2B)。

2.2.2ThSAMS基因二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

根據(jù)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)ThSAMS二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲，α-螺旋和β-折疊組成。其中以無規(guī)則卷曲為主，占46.67%(約184個氨基酸)，其次是α-螺旋占29.74%(約117個氨基酸)，其中β-折疊占23.59%(約93個氨基酸)(圖3A)。利用Protscale分析發(fā)現(xiàn)(圖3B)，親水氨基酸均勻的分布在整個ThSAMS編碼蛋白質(zhì)的肽鏈上且具有明顯的親水區(qū)，整條多肽鏈表現(xiàn)為親水性。利用SignlP4.1Server進(jìn)行氨基酸序列信號肽分析發(fā)現(xiàn)ThSAMS基因編碼的蛋白沒有信號肽存在(圖3C)。

2.2.3 ThSAMS蛋白的亞細(xì)胞定位分析

利用Psort對ThSAMS蛋白的亞細(xì)胞進(jìn)行定位預(yù)測，表2是可能定位在細(xì)胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞核、過氧化氫酶和質(zhì)膜上的概率，結(jié)果顯示定位在細(xì)胞質(zhì)概率最大(60.9%)，其它定位概率較小，表明ThSAMS可能定位在細(xì)胞質(zhì)中。

表2 ThSAMS亞細(xì)胞定位

圖2 剛毛檉柳ThSAMS基因序列及保守區(qū)結(jié)構(gòu) A.ThSAMS基因cDNA序列及其推測的氨基酸序列；B.ThSAMS保守區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Nucleotide sequence and putative conserved domains of ThSAMS A.Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of ThSAMS; B.Putative conserved domains of ThSAMS

圖3 ThSAMS蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析 A.ThSAMS二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.ThSAMS蛋白質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)預(yù)測；C.ThSAMS蛋白信號肽預(yù)測Fig.3 Bioinformatics analysis of ThSAMS protein A. Secondary structure prediction of ThSAMS; B. Hydrophobicity analysis of ThSAMS; C. Signal P-NN prediction for ThSAMS protein

2.2.4ThSAMS基因編碼氨基酸序列的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用NCBI的Smart BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性分析比較，發(fā)現(xiàn)ThSAMS蛋白與其他植物的SAMS蛋白氨基酸序列具有較高的一致性，利用Bioedit對ThSAMS蛋白與已知10種不同植物(NtSAMS煙草；HbSAMS橡膠樹；DzSAMS榴蓮；CcSAMS黃麻；TcSAMS可可；CaSAMS辣椒；GhSAMS陸地棉；McSAMS苦瓜；GbSAMS海島棉；ZjSAMS棗)SAMS基因編碼的蛋白進(jìn)行同源性序列比較(圖4)。結(jié)果表明，與其他物種的SAMS一樣，ThSAMS蛋白具有S-AdoMet_synt_C家族典型的結(jié)構(gòu)域。其可能在剛毛檉柳SAM的生物合成過程中扮演著重要的角色，是細(xì)胞內(nèi)影響生命活動的關(guān)鍵。ThSAMS基因編碼的氨基酸序列與煙草、海島棉的SAMS氨基酸序列相似度高達(dá)92%，與榴蓮、黃麻、可可、辣椒、陸地棉、苦瓜的SAMS氨基酸序列相似度高達(dá)93%，與橡膠樹的SAMS氨基酸序列相似度高達(dá)94%，其中與棗的的SAMS氨基酸序列最相似度高達(dá)95%，說明該基因在植物進(jìn)化中非常保守。

為更好地研究進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建幾種植物SAMS基因編碼蛋白同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示剛毛檉柳SAMS與棗SAMS親緣關(guān)系最近，二者間可能有相似的功能。

2.3 ThSAMS基因的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步研究ThSAMS基因表達(dá)的組織特異性及其對逆境脅迫的響應(yīng)情況，采用實時RT-PCR方法分析其正常生長和脅迫處理下的表達(dá)模式。正常生長情況下，ThSAMS在檉柳的地上和地下部分都表達(dá)，但是其在地上部分的表達(dá)量是地下部分組織中2.36倍(圖6)。在0.4 mol·L-1NaCl和20% PEG和外源ABA處理下，ThSAMS的表達(dá)都發(fā)生了變化，但在不同處理條件和不同組織中的表達(dá)模式有所差異(圖7)。

在NaCl脅迫下，ThSAMS基因在檉柳中受到了不同程度的表達(dá)，其中ThSAMS基因在檉柳地上部分表達(dá)上調(diào)，表達(dá)量逐漸上升，在12 h時表達(dá)量達(dá)到峰值，約為對照表達(dá)量的14.4倍；ThSAMS基因在檉柳根部組織表達(dá)下調(diào)，表達(dá)量在2 h達(dá)到頂峰后逐漸下降，在48 h時表達(dá)量達(dá)到最低，下調(diào)了0.07倍；與地下部分相比，ThSAMS表達(dá)在地上部分中誘導(dǎo)程度更高。

圖5 幾種植物SAMS蛋白同源序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 標(biāo)尺代表每單位氨基酸的變化，0.01代表兩個序列之間1%的差異。Fig.5 Phylogenetic tree analysis of SAMS proteins from various plant species The scale bar expected number of substitutions per site,0.01means 1% changes were observed between two sequences.

圖6 ThSAMS基因在剛毛檉柳組織器官中的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of ThSAMS gene in T.hispida under different tissues

圖7 ThSAMS基因在不同脅迫下的表達(dá)模式分析 基因相對表達(dá)量=2^-ΔΔCt，>1代表上調(diào)表達(dá)；=1代表表達(dá)無變化；<1代表下調(diào)表達(dá)。Fig.7 Expression analysis of ThSAMS gene under different abiotic stresses Relative expression level was 2^-ΔΔCt;>1 upregulation;=1,no change in regulation;<1,downregulation

在模擬干旱PEG脅迫下，ThSAMS基因在檉柳中呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)且呈現(xiàn)雙峰型特征。地上部分分別在2和12 h其相對表達(dá)量達(dá)到峰值。ThSAMS基因在地下根部組織中與地上部分的表達(dá)具有相似性，在脅迫6h時達(dá)到峰值后逐漸降低，在24 h時再次達(dá)到峰值后逐漸下降。與地上部分相比，ThSAMS基因的表達(dá)在地下根部組織中隨著脅迫時間的增加變化比較平緩。

在外源ABA處理下，ThSAMS基因在檉柳不同組織中呈現(xiàn)截然不同的表達(dá)模式。在地上部分組織中，ThSAMS基因的表達(dá)沒有發(fā)生明顯變化；而在地下部分組織中，ThSAMS基因受ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，處理48 h時表達(dá)量是對照的5.38倍。

上述實驗結(jié)果表明，ThSAMS基因在NaCl和PEG脅迫處理后剛毛檉柳地上和地下組織的表達(dá)均能產(chǎn)生不同程度的改變，推測該基因可能參與檉柳抗旱耐鹽生理過程。但是，在外源ABA處理下ThSAMS基因在檉柳地上和地下組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，表明其在不同組織中可能受不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所調(diào)控。

3 討論

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是生物體中一種重要的生理活性物質(zhì)，參與了多胺、乙烯和谷胱甘肽等物質(zhì)的合成和代謝過程，而這些物質(zhì)在植物抵御逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[22～23]。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)作為SAM合成的催化酶，也直接參與調(diào)節(jié)植物對多種逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[14,24～25]。本研究首次從剛毛檉柳中克隆到一個編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因ThSAMS的全長序列,序列分析表明,ThSAMS與其他物種的SAMS氨基酸序列具有很高的相似性，并且也包含了三個保守結(jié)構(gòu)域：N端的蛋氨酸結(jié)合基序(GHPDK)、中間結(jié)構(gòu)域(GAGDQGHMFGY)和C端ATP結(jié)合基序結(jié)構(gòu)域(GGGAFSGKD)，表明該基因?qū)賁AMS成員。

目前，多種植物中的SAMS基因已被克隆鑒定，研究發(fā)現(xiàn)SAMS基因表達(dá)受多種逆境脅迫誘導(dǎo)。鹽地堿蓬、煙草和陸地棉的SAMS受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[26～28]。Ding等克隆了離子芥中SAMS基因，該基因表達(dá)受低溫、乙烯和鹽脅迫誘導(dǎo)[24]；黃瓜CsSAMs受NaCl、PEG、高溫和低溫等脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[29]；黑穗病菌脅迫和低溫(4℃)、PEG、NaCl等非生物脅迫均能誘導(dǎo)甘蔗ScSAM的表達(dá)[30]。這些研究暗示SAMS基因可能在植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Gong等[28]將SAMS1基因轉(zhuǎn)入番茄中，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的亞精胺(Spd)和精胺(Spm)的含量顯著提高，抗鹽堿脅迫的能力顯著增強(qiáng)[27]；石蒜SAMS基因能夠提高植物多胺和乙烯的含量，加速了細(xì)胞壁木質(zhì)化，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力[31]。紫花苜蓿MfSAMS1在葉片中的表達(dá)受到了冷、脫落酸(ABA)、H2O2和一氧化氮(NO)誘導(dǎo),過表達(dá)MfSAMS1促進(jìn)了多胺的合成，改善細(xì)胞的抗氧化能力，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因植物對冷和低溫脅迫的耐受性[32]。鹽、甘露醇、乙烯、IAA和ABA處理增強(qiáng)了馬鈴薯SbSAMS的表達(dá)水平，SbSAMS過表達(dá)擬南芥的乙烯積累增加，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較高的耐鹽性和抗旱性[33]。須芒草AvSAMS1在擬南芥中過量表達(dá)，通過使組蛋白H3(H3K4me3和H3K9me3)甲基化，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對Al、Pb、Cu和Zn等脅迫的抗性[34]。以上研究表明，SAMS能夠調(diào)控植物體內(nèi)多胺、乙烯、木質(zhì)素等物質(zhì)的合成和積累，來改變植物抵御逆境脅迫的能力。同時，SAMS通過參與DNA甲基化和組蛋白甲基化修飾也影響著植物的抗逆性。但這些SAMS參與的抗逆代謝通路之間是否存在偶聯(lián)目前尚不清楚。SAMS的抗逆功能在植物基因工程育種工作中存在潛在的應(yīng)用前景，因此，SAMS具有較高的研究價值。為了深入了解SAMS基因在檉柳非生物脅迫應(yīng)答中的功能，本研究利用熒光定量PCR技術(shù)分析了ThSAMS在NaCl、PEG和ABA處理下的表達(dá)情況。在地上部分組織中，ThSAMS基因的表達(dá)受NaCl和PEG的誘導(dǎo)，脅迫后基因表達(dá)量顯著上升，這與上述其它植物SAMS基因表達(dá)分析的研究結(jié)果一致。但是，在檉柳地下部分組織中，ThSAMS基因表達(dá)變化并不明顯，表明在脅迫條件下其表達(dá)具有一定的組織特異性。與NaCl和PEG脅迫下的結(jié)果不同，在外源ABA處理后，ThSAMS基因在檉柳地下部分組織中表達(dá)上調(diào)，而在地上部分組織中沒有變化。綜合上述結(jié)果，我們推測ThSAMS可能參與剛毛檉柳對高鹽和干旱的脅迫應(yīng)答反應(yīng)，其主要在檉柳的莖、葉組織中行使功能，且并不依賴ABA信號通路。本研究為進(jìn)一步揭示ThSAMS基因在檉柳高鹽、干旱脅迫應(yīng)答中的具體功能及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。