丁一巍 詹亞光* 張佳薇 何利明

(1.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

PLT(Plethora)為AP2/ERF型轉(zhuǎn)錄因子，其在根發(fā)育過程中起到了建成根尖分生組織細胞的作用[1～2]，在擬南芥根發(fā)育過程中通過響應生長素的累積而轉(zhuǎn)錄，同時其活性又能調(diào)控生長素的極性運輸和生物合成，以直接控制生長素水平，形成一個反饋調(diào)節(jié)環(huán)來維持穩(wěn)定的生長素濃度和根尖干細胞龕的位置[3～5]。

近些年，隨著模式植物根發(fā)育研究的深入，發(fā)現(xiàn)有兩個遺傳途徑調(diào)控擬南芥根尖分生組織干細胞龕，并共同決定干細胞的命運：一個是依賴生長素和PLT濃度梯度的途徑[1]；另一個是調(diào)控根尖皮層和內(nèi)皮層的SCR(SCARECROW)-SHR(SHORT-ROOT)途徑[6～7]。有研究表明，在PLT途徑中有兩條通路影響著PLT轉(zhuǎn)錄因子基因的表達：一條是由酪氨酸磺基轉(zhuǎn)移酶TPST(tyrosylprotein sulfotransferase)[6]和根分生生長因子RGFs(root meristem growth factor)共同介導的調(diào)控通路[8]，另一條是由生長素響應因子ARFs(auxin response factors)介導的根發(fā)育通路[9～10]。這兩條獨立的通路都是通過PINs(pin-formed)家族蛋白介導生長素極性運輸來實現(xiàn)的，它們轉(zhuǎn)運生長素，使其形成一定的濃度梯度，作用于下游的PLT基因。最終實現(xiàn)PLT途徑與SCR途徑協(xié)同調(diào)控根尖分生組織中的靜止中心QC(quiescent center)，進而決定根尖分生組織細胞的命運[11～12]。有研究報道發(fā)現(xiàn)，PLT蛋白存在劑量效應，生長素的梯度分布能夠引起PLT表達的差異：高水平的PLT活性維持干細胞特性，低水平PLT活性誘導干細胞子細胞的有絲分裂活動，更低水平的PLT活性才可促使細胞分化[1～2,13]。在PLT轉(zhuǎn)錄因子當中，PLT1和PLT2通過在根尖干細胞龕周邊形成的濃度梯度來維持根尖分生組織細胞的形態(tài)[1～2]。而PLT3、PLT5和PLT7不但能冗余地調(diào)節(jié)側(cè)根原基的啟動，還保障了對稱生長軸中基因表達程序的正確建立[8,14]。

水曲柳(Fraxinusmandshurica)屬于木犀科(Oleaceae)白蠟屬(Fraxinus)闊葉經(jīng)濟木材樹種，廣泛分布于中國東北部和西北部，俄羅斯遠東地區(qū)，朝鮮半島北部及日本北部[15]。因其良好的質(zhì)量與質(zhì)地而被用于家具和特殊建筑材料。但由于長期過度開采，中國現(xiàn)存的水曲柳純林極少，已被列為國家瀕危保護樹種[16]。目前，在水曲柳根系研究中，大多數(shù)都是生態(tài)學與林學的宏觀分析[17～19]，還有部分為建立植株再生體系而進行的離體根系的組織培養(yǎng)和抗逆境的研究[20～22]。

根系作為植物之本，其發(fā)育的好壞直接影響植物體的生長狀況，與林業(yè)生產(chǎn)息息相關(guān)[23]。所以，本研究以RNA-Seq測序技術(shù)得到的水曲柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，克隆獲得了2個PLT轉(zhuǎn)錄因子FmPLT2和FmPLT3基因，進行了生物信息學分析以及組織特異性表達分析，并通過植物激素對組培苗的生根處理來分析這兩個基因在生根過程中的表達情況，以期為水曲柳PLT轉(zhuǎn)錄因子基因功能和根發(fā)育的研究提供參考[24]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以水曲柳組培苗、兩月生實生苗和二十年生水曲柳雄花為試驗材料，于液氮冷凍處理后，置-80℃超低溫冰箱備用(上述材料取于東北林業(yè)大學生命科學學院培養(yǎng)溫室和實驗林場)。

1.2 實驗試劑

CTAB提取RNA的所有試劑均購于上海滬試公司；DNA膠回收試劑盒購于Omega Bio-tek公司；LA-taq聚合酶購于Takara生物公司；pEASY?-T5 Zero Cloning Kit、TranScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart? Tip Green qPCR SuperMix均購于北京全世金生物公司。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

利用CTAB法提取水曲柳兩月生整株實生苗的總RNA，并分別提取實生苗根、莖、葉、芽和二十年生水曲柳雄花的總RNA，以及生根處理后第0、7、14和21天這4個時間的整株組培苗的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4 FmPLT2和FmPLT3全長基因克隆

以水曲柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，參照擬南芥基因組序列，對FmPLT2和FmPLT3基因分別設(shè)計特異性引物(表1)，以水曲柳整株苗cDNA為模板分別進行PCR擴增。PCR的反應體系為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保持。應用膠回收試劑盒將擴增產(chǎn)物回收純化，純化產(chǎn)物與pEASY-T5載體連接，轉(zhuǎn)化進入Trans-T1感受態(tài)，送生工生物工程(上海)公司測序。

表1水曲柳FmPLT2和FmPLT3基因克隆及Real-timePCR分析所用引物

Table1PrimersusedinFmPLT2andFmPLT3genescloningandReal-timePCRanalysisinF.mandshurica

引物Primers正向引物序列Forward primer sequence(5'→3')反向引物序列Reverse primer sequences(5'→3')FmPLT2ATGAATTCCAACAATTGGCTTTTTTCAATCATTCCACATTGTGAAFmPLT3GCGAAATGGCACCAGAAAATACGAGTCAGACGAAAGGTCAGTTFmTUAGGACGCTGCCAACAACTTTTTGAGGGGAAGGGTAAATAGTGFmPLT2-qTGACACTCCGCTTCATAACCAAACAGATAATCGGAACCACTCGFmPLT3-qGGAACATTTGCTACTGAGGAGGGAGATTATGATGATAGAATGGGGC

1.5 FmPLT2和FmPLT3基因序列分析

用NCBI在線工具中的ORF Finder預測目的基因的ORF。通過ExPASy-ProParam、SMART、SignalP4.1等在線軟件對目的基因編碼的氨基酸序列、相對分子質(zhì)量、理論pI值、親水性/疏水性等理化性質(zhì)進行基礎(chǔ)分析。利用SOPMA、ExPASy中的SWISS-MODEL、Psort等在線軟件分別對水曲柳PLT轉(zhuǎn)錄因子蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及亞細胞定位情況進行預測分析。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得同源性較高的其他物種的PLT基因編碼的氨基酸及核苷酸序列，整理后導入MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。用ClustalX1.8軟件對不同物種的PLT轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域進行多重序列比對。

1.6 FmPLT2和FmPLT3基因的表達分析

將制備的各組織部位與各生根時間的cDNA樣品作為模板，根據(jù)測序的水曲柳FmPLT2和FmPLT3基因的全長序列，設(shè)計Real-time PCR引物(FmPLT2-q和FmPLT3-q，表1)，并以水曲柳TU基因作為內(nèi)參，引物為FmTU(表1)[25]。按照TransStart? Tip Green qPCR SuperMix試劑盒中20 μL反應體系的說明加樣，在ABI-7500熒光定量PCR儀上進行Real-time PCR反應。每個樣品技術(shù)重復3次，分析數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法(ΔΔCt=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)實驗組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組)[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 FmPLT2和FmPLT3基因全長基因的獲得

以水曲柳兩月生實生苗的cDNA為模板進行克隆，分別獲得了兩條1 500 bp左右的片段(圖1)。經(jīng)測序，F(xiàn)mPLT2和FmPLT3基因的開放閱讀框長度分別為1 599和1 494 bp，分別編碼了532和497個氨基酸(圖2)。利用在線軟件SMART分別對其保守結(jié)構(gòu)域進行預測，F(xiàn)mPLT2在168-240和270-334含有AP2結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)mPLT3在224-296和326-390含有AP2結(jié)構(gòu)域。AP2是PLT轉(zhuǎn)錄因子家族的特征結(jié)構(gòu)域，進一步確認它們編碼了PLT轉(zhuǎn)錄因子，將所得序列命名為FmPLT2和FmPLT3。

圖1 FmPLT2(A)和FmPLT3(B)基因克隆Fig.1 PCR product of FmPLT2 and FmPLT3

圖2 FmPLT2(A)和FmPLT3(B)基因核苷酸序列及其編碼氨基酸序列 灰色陰影區(qū)域為AP2結(jié)構(gòu)域；“*”代表終止密碼子Fig.2 The nucleotide and encoded amino acid sequence of FmPLT2(A) and FmPLT3(B) Gray shaded area is the AP2 domain；“*” represents the stop codon

2.2 FmPLT2和FmPLT3蛋白生物信息學分析

2.2.1 FmPLT2和FmPLT3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

利用在線軟件預測了FmPLT2和FmPLT3基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，相對分子量分別為59和55 kDa左右，等電點分別為5.98和5.79，脂肪系數(shù)分別為61.65和59.76，半衰期都是30 h，不穩(wěn)定系數(shù)分別為46.09和52.11，均為不穩(wěn)定蛋白。兩種蛋白中絲氨酸含量均最高，分別占總氨基酸含量的11.7%和10.9%。

利用Protscal在線軟件預測了水曲柳FmPLT2和FmPLT3蛋白的親水性和疏水性，F(xiàn)mPLT2平均親水系數(shù)為-0.712，F(xiàn)mPLT3平均親水系數(shù)為-0.600。通過親水性分布圖看到FmPLT2多肽鏈第280位的氨基酸最低分為-3.022，親水性最強，第454位氨基酸最高分為1.367，疏水性最強。而FmPLT3多肽鏈的第62位氨基酸最低分為-3.511，親水性最強，第434位氨基酸最高分為1.456，疏水性最強。根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強的規(guī)律，推測FmPLT2和FmPLT3這兩個蛋白都為親水性蛋白。經(jīng)SignalP 4.1 Server預測FmPLT2和FmPLT3均無信號肽，且通過TMHMM Server.2.0預測兩種蛋白均無跨膜區(qū)域，全部位于膜外。

2.2.2 FmPLT2和FmPLT3蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

利用在線軟件對FmPLT2和FmPLT3的二級結(jié)構(gòu)進行預測，F(xiàn)mPLT2蛋白由α螺旋(23.31%)、β折疊(16.17%)、β轉(zhuǎn)角(3.95%)、無規(guī)則卷曲(56.58%)組成，F(xiàn)mPLT3蛋白由α螺旋(25.35%)、β折疊(13.08%)、β轉(zhuǎn)角(4.83%)、無規(guī)則卷曲(56.74%)組成，說明這兩個蛋白的二級結(jié)構(gòu)都以無規(guī)則卷曲為主。

2.2.3 FmPLT2和FmPLT3蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

利用在線軟件預測FmPLT2和FmPLT3的三級結(jié)構(gòu)模型(圖3)?？梢詮哪Ｐ椭锌闯鯢mPLT2蛋白三級結(jié)構(gòu)預測與二級結(jié)構(gòu)預測相似，都以α螺旋和β折疊為主要組成部分，而FmPLT3蛋白的三級結(jié)構(gòu)則是以β折疊為主，α螺旋相對較少。

圖3 FmPLT2(A)和FmPLT3(B)三級結(jié)構(gòu)預測模型Fig.3 Predicted three-dimensional configuration of FmPLT2 and FmPLT3

2.2.4 FmPLT2和FmPLT3蛋白亞細胞定位預測

利用在線軟件對FmPLT2和FmPLT3蛋白進行亞細胞定位，預測結(jié)果顯示FmPLT2在細胞核中的概率是82.6%，在細胞質(zhì)和線粒體中的概率都為8.7%；FmPLT3在細胞核中的概率為69.6%，在細胞質(zhì)中為17.4%，在線粒體中為8.7%，在過氧化物酶體中為4.3%。利用NetPhos 2.0 Server預測蛋白的磷酸化位點，結(jié)果顯示FmPLT2蛋白含有24個絲氨酸位點、5個蘇氨酸位點和8個酪氨酸位點，F(xiàn)mPLT3蛋白含有27個絲氨酸位點、8個蘇氨酸位點和5個酪氨酸位點。

2.3 FmPLT2和FmPLT3蛋白保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進化分析

分別以FmPLT2和FmPLT3蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索與水曲柳FmPLT2和FmPLT3蛋白同源性較高的其他物種的氨基酸序列進行比對。包括油橄欖(Oleaeuropaea)、毛果楊(Populustrichocarpa)、可可(Theobromacacao)、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)、木薯(Manihotesculenta)、榴蓮(Duriozibethinus)、胡桃(Juglansregia)、煙草(Nicotianatabacum)的PLT2氨基酸序列和油橄欖(Oleaeuropaea)、毛果楊(Populustrichocarpa)、芝麻(Sesamumindicum)、葡萄(Vitisvinifera)、絨毛煙草(Nicotianatomentosiformis)、野生煙草(Nicotianaattenuata)、番木瓜(Caricapapaya)、番茄(Solanumlycopersicum)的PLT3氨基酸序列。利用MEGA7.0軟件通過鄰近法(Neighbour-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖4)。從圖4中能夠看出水曲柳PLT轉(zhuǎn)錄因子與同屬木犀科的油橄欖親緣關(guān)系最為緊密，其次是PLT3與芝麻的關(guān)系較為親近。

圖4 FmPLT2和FmPLT3蛋白與部分植物PLT蛋白的同源性比較Fig.4 Homologous comparison of FmPLT2 and FmPLT3 protein with PLT protein from other species

圖5 FmPLT2和FmPLT3蛋白同源序列比對 底部小寫字母表示保守氨基酸；“·”表示缺失；黑色、粉色、綠色、黃色分別表示保守性為100%、≥75%、≥50%、≥33%的氨基酸；A和B為PLT轉(zhuǎn)錄因子的AP2結(jié)構(gòu)域。Fig.5 Homologous alignments of FmPLT2 and FmPLT3 protein Lowercase letters at the bottom indicate conservative amino acids; “·” represents missing; The shadow of the black, pink, green, yellow represent conservative amino acids were 100%,≥75%,≥50%,≥33%; A and B are the AP2 domains of the PLT transcription factor.

利用Clustal X1.8將水曲柳、油橄欖、毛果楊等不同物種的PLT2和PLT3蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域多重比對分析(圖5)。結(jié)果顯示水曲柳FmPLT2蛋白與油橄欖OePLT2(XP_022874541.1)蛋白一致性最高，為70.30%，與毛果楊PLT1(XP_024453004.1)的一致性次之，為58.42%，與可可(XP_017982598.1)、巴西橡膠樹(XP_021645779.1)、榴蓮(XP_022756268.1)、煙草(XP_018807472.1)、木薯(XP_021634694.1)、胡桃(XP_018807472.1)PLT2蛋白一致性近似，分別為57.57%、57.00%、57.00%、56.86%、56.44%和56.29%。FmPLT3蛋白與油橄欖OePLT3(XP_022893842.1)一致性最高，為67.19%，與芝麻PLT3(XP_011097469.1)的一致性次之，為56.39%，與番木瓜(XP_021897531.1)、葡萄(XP_003635541.1)PLT3的一致性近似，分別為47.81%和47.52%，與番茄(XP_004250153.2)、絨毛煙草(XP_009603183.1)、野生煙草(XP_019245429.1)及毛果楊(XP_024460943.1)PLT3的一致性最差，分別為45.54%、45.50%、45.40%和44.13%。

2.4 FmPLT2和FmPLT3基因的表達分析

分別取水曲柳兩月生實生苗的根、莖、葉、芽及水曲柳二十年生雄花，通過熒光定量檢測FmPLT2和FmPLT3在不同組織中的表達情況(圖6A)。從圖6中可以看出，F(xiàn)mPLT2和FmPLT3在根中的表達量都高于在其他組織中的表達量，且在葉中的表達量均為最低。特別是FmPLT2在根中的表達量是葉中表達量的27.5倍之多。

通過不同組織的表達分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mPLT2和FmPLT3在根中的表達量均高于其他組織，所以想利用水曲柳組培苗生根過程來進一步探究這兩個基因在生根過程中的表達情況(圖6B)。本研究將生根處理前視為第0天，生根處理后第7、14和21 d視為生根第7、14和21 d。結(jié)果表明，F(xiàn)mPLT2在生根7天時的表達量顯著升高，而FmPLT3在7天時與0天(未生根)時的表達量相比變化不明顯。且FmPLT3的表達量在生根14天時達到高峰，是0天時表達量的3.8倍，隨后下調(diào)；而FmPLT2的表達量卻在7天后逐漸增長，隨后進入緩慢上升狀態(tài)，并在21天時達到高峰，是0天時表達量的32倍。

圖6 水曲柳PLT基因的表達分析 A.不同組織中兩個基因的表達量；B.不同生根天數(shù)時兩個基因的表達量Fig.6 F.mandshurica PLT genes expression analysisA. Expression levels of two genes in different tissues; B. Expression levels of two genes in different rooting days

3 結(jié)論與討論

近年來，植物根系發(fā)育的研究取得了顯著的成果，其中PLT轉(zhuǎn)錄因子在根尖分生組織生長素遺傳調(diào)控網(wǎng)絡中起到了非常重要的作用，且實現(xiàn)了對PLT轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控通路的初步探究[3]。其中還包括PLT基因在根——芽轉(zhuǎn)化體系中的研究，研究表明由于PLT基因與控制莖尖分生組織發(fā)育的關(guān)鍵基因CUC2(CUPSHAPED-COTYLEDON)之間的調(diào)控關(guān)系，致使其在擬南芥芽再生通路中也發(fā)揮重要作用[27]。由于PLT基因與生長素的互作關(guān)系，使之成為葉原基發(fā)育與花發(fā)育通路的關(guān)鍵一環(huán)[9,28～29]。

目前，對PLT轉(zhuǎn)錄因子進行研究主要集中在擬南芥、小立碗蘚和水稻等草本植物中[30～32]。水曲柳是“東北三大硬闊”之一，提高其繁殖規(guī)模對人工造林有著重大意義，但目前對水曲柳根系發(fā)育的研究報道甚少。本研究克隆了兩個水曲柳PLT轉(zhuǎn)錄因子基因FmPLT2和FmPLT3。通過對核苷酸序列及編碼產(chǎn)物生物信息學的分析發(fā)現(xiàn)，這兩個基因各含有2個AP2特征結(jié)構(gòu)域，且蛋白都為親水性蛋白。同源序列比對及系統(tǒng)進化樹分析表明，它們與同屬木犀科的油橄欖OePLT2和OePLT3蛋白的同源性最高，與毛果楊PtPLT1和PtPLT3蛋白也有較高的一致性，可預測FmPLT2和FmPLT3轉(zhuǎn)錄因子在水曲柳根系發(fā)育過程中起到調(diào)控根尖分生組織規(guī)模的基點作用。通過亞細胞定位發(fā)現(xiàn)FmPLT3蛋白有一定概率存在于過氧化物酶體中，且過氧化物酶在細胞中參與植物細胞內(nèi)吲哚乙酸的氧化分解和木質(zhì)素的形成，從而起調(diào)節(jié)細胞的伸長和次生壁木質(zhì)化的作用，也可作為組織老化的一種生理指標[33～34]?？蛇M一步推測FmPLT3在根系發(fā)育時發(fā)揮作用。另外，也有研究者通過毛果楊PtPLT1(與FmPLT2同源)的表達來分析根系發(fā)育情況的報道[35]?？蛇M一步推測FmPLT2在水曲柳根原基發(fā)生起重要作用。

同時，表達分析表明FmPLT2和FmPLT3基因在根中的表達量均高于其他組織，且利用植物激素對無根組培苗進行生根處理前后，兩個基因都具有差異性的變化(圖6B)。在處理后第7天，組培苗并沒有根的發(fā)生，但FmPLT2基因表達卻發(fā)生明顯變化；而第14天時根系逐漸發(fā)生，此時FmPLT3基因才發(fā)生顯著變化；在第21天時根生長處于最旺盛階段，F(xiàn)mPLT2始終活躍的調(diào)控植株的生長發(fā)育，而FmPLT3在根發(fā)生后開始下調(diào)。雖然整個生根過程中FmPLT3的表達量變異幅度沒有FmPLT2的表達量顯著，但以往的都是將擬南芥AtPLT3、AtPLT5和AtPLT7這三個基因結(jié)合研究它們在根發(fā)育中的冗余作用[14]。所以對PLT3基因功能的研究還需更深層次的推進。而FmPLT2的顯著變化可能與其參與細胞增殖和生長等多個發(fā)育途徑有關(guān)[36]。但是上述推測有待進一步深入研究和驗證，而本研究將作為后續(xù)水曲柳根系發(fā)育遺傳網(wǎng)絡調(diào)控的初步探索。