周利君 于 超 常 笑 萬會(huì)花 羅 樂 潘會(huì)堂 張啟翔

(花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083)

月季(Rosaspp.)是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(RosaL.)的一個(gè)重要類群[1]。通過薔薇屬內(nèi)種間反復(fù)雜交和長期選育，形成了色彩絢麗的現(xiàn)代月季雜交品種群[2]，被譽(yù)為“花中皇后”。同時(shí)，作為我國十大傳統(tǒng)名花之一，月季栽培歷史悠久、來源廣泛、種類豐富、適應(yīng)性強(qiáng)、栽培養(yǎng)護(hù)簡單、生產(chǎn)繁殖相對容易，園林應(yīng)用形式多樣且商品用途眾多[3]?；谄涓哂^賞價(jià)值和可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，月季一直是全世界的生產(chǎn)商和研究者所關(guān)注的對象[4]。中國是薔薇屬植物的分布中心，擁有栽培歷史悠久的古老月季品種資源，是進(jìn)行月季品種改良的重要遺傳資源[5]，將其和遺傳背景復(fù)雜的現(xiàn)代月季優(yōu)良品種雜交，有利于利用雜種優(yōu)勢進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的月季新品種[6～7]。

植物大多數(shù)觀賞性狀都是由微效多基因控制的數(shù)量性狀，在一個(gè)自然群體或者同一雜交后代群體的不同個(gè)體中往往表現(xiàn)出連續(xù)的數(shù)量差異，易受環(huán)境影響，不易明確分組歸類[8]，需要應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對整個(gè)群體進(jìn)行的系統(tǒng)測定和分析[9]。由于薔薇屬觀賞植物遺傳組成上高度雜合和復(fù)雜、染色體倍性水平差異較大、種子高度木質(zhì)化及后熟造成萌發(fā)困難，通過常規(guī)育種手段對其觀賞性和抗性相關(guān)的數(shù)量性狀研究較為困難[10]。以構(gòu)建高密度遺傳圖譜為基礎(chǔ)進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)QTLs(Quantitative Trait Locus)定位成為數(shù)量性狀遺傳研究的常用方法，目標(biāo)性狀相關(guān)遺傳信息及等位基因的跟蹤和選擇可以通過構(gòu)建圖譜得以實(shí)現(xiàn)[11]。

目前，薔薇屬植物的花瓣數(shù)量、花期、花香、花色、花徑、生長勢、皮刺、株形和抗白粉病等多個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行了QTLs定位，但是目前直接對二維性狀花冠面積以及細(xì)部性狀花瓣長寬等研究報(bào)道較少。另一方面，植株葉片的形態(tài)特征，如葉長、葉寬不僅影響植株的觀賞效果，還與植株光合產(chǎn)物積累相關(guān)，也與花朵的表現(xiàn)形態(tài)也有一定關(guān)聯(lián)性[12]；本研究利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對月季雜交群體的表型性狀進(jìn)行測定分析，了解和掌握該群體花部7個(gè)具體性狀以及葉片2個(gè)表型性狀的遺傳變異規(guī)律及相關(guān)性，以期為月季表型性狀的QTLs定位提供理論基礎(chǔ)和參考數(shù)據(jù)，對于薔薇屬植物優(yōu)良基因的挖掘及輔助選擇育種具有實(shí)際意義[13]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

2011年4～6月，以1株四倍體古老月季品種‘云蒸霞蔚’(Rosa‘Yunzheng Xiawei’)為母本，收集另1株四倍體現(xiàn)代月季品種‘太陽城’(R.‘Sun City’)的花粉進(jìn)行雜交，采收成熟果實(shí)于2012年3月進(jìn)行播種，獲得333株F1代實(shí)生苗群體。該群體露地種植于北京市昌平區(qū)國家花卉工程技術(shù)研究中心苗圃，年平均日照時(shí)數(shù)2 684 h，年平均氣溫11.8℃，年平均降水量550.3 mm，個(gè)體栽植點(diǎn)的溫度、光照、水分、土壤等環(huán)境因子基本相同，生長健壯、表現(xiàn)穩(wěn)定。隨機(jī)選擇184株雜交F1代群體和雜交親本作為研究對象(表1)。

表1 試驗(yàn)材料主要信息

1.2 試驗(yàn)方法

該群體2個(gè)集中花期(2016年9月、2017年5月)內(nèi)，測定2株親本及184株子代的花部和葉片性狀(表2)。

1.2.1 花部性狀的測量方法

每個(gè)單株上選3朵開放程度到圖1所示第五個(gè)階段的花朵，分別進(jìn)行如下性狀的測量：

(1)花朵直徑：測量如圖2所示，過輻射對稱中心測量花朵直徑，每朵花測量3次。

(2)花冠面積：采用圖片采集法[14]。測量時(shí)，將直尺與花俯視角度的圖像位于同一平面(與地表平行)拍照，后期利用Adobe Photoshop 2015進(jìn)行處理。根據(jù)直尺上的標(biāo)記確定參照面積RA(Reference substance Area)=1 cm2，記錄參照面積所占用的像素RP(Reference substance Pixel)，使用磁性套索工具，選擇待測花冠面積，記錄待測面積所占用的像素，記為FP(Flower Pixel)，依據(jù)待測面積/參照面積=待測面積像素/參照面積像素的比例關(guān)系，即FA=RA×FP÷RP，計(jì)算待測花冠面積FA(Flower Area)=FP÷RP(單位：cm2)。

表2 性狀選取與測定標(biāo)準(zhǔn)

圖1 測量取材示意圖Fig.1 A method diagram of the measurement

圖2 花朵直徑測量示意圖Fig.2 A schematic diagram for measuring corolla diameters

圖3 花瓣長、寬測量示意圖Fig.3 A schematic diagram for measuring the length and width of petals

(3)花瓣數(shù)量和瓣化情況：對花瓣數(shù)量進(jìn)行直接統(tǒng)計(jì)，重瓣性高的子代待花瓣完全打開后進(jìn)行計(jì)數(shù)，雄蕊瓣化特別明顯的計(jì)入其中。參照國家林業(yè)局于2010年發(fā)布的《薔薇屬植物新品種特異性、一致性、穩(wěn)定性測試指南》，采用統(tǒng)計(jì)與篩選的方法將花瓣數(shù)量的平均值按照單瓣花(<10)、半重瓣花(10～20)、重瓣花(20～50)及千重瓣(>50)4類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別賦值為0、1、2和3；未瓣化和瓣化賦值為0和1。

(4)花瓣長和花瓣寬：分別選取3朵花各1枚花瓣(重瓣花選取從外至內(nèi)第2～3輪的平展花瓣，單瓣花直接用該輪花瓣)進(jìn)行如圖3的測量，花瓣中軸線為花瓣長，與中軸垂直的花瓣最寬處為花瓣寬。

(5)萼片附屬物：觀測萼片的形態(tài)，統(tǒng)計(jì)并記錄是否存在明顯的附屬物(將無附屬物、有毛、小刺、明顯刺分別賦值0、1、2和3)。

1.2.2 葉片性狀的測量方法

參照國家林業(yè)局于2010年發(fā)布的《薔薇屬植物新品種特異性、一致性、穩(wěn)定性測試指南》，使用游標(biāo)卡尺對每個(gè)單株盛花期時(shí)花枝下第3側(cè)枝頂葉進(jìn)行測量，重復(fù)測量3枚葉片，葉長以葉基到葉尖的距離為準(zhǔn)，葉寬以葉片最寬處為準(zhǔn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測量和計(jì)算所得數(shù)據(jù)通過Excel 2013、SPSS 24.0等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過平均值、標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算得出變異系數(shù)(CV=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值)，用以衡量表型性狀在群體內(nèi)的變異水平。通過描述性統(tǒng)計(jì)、遺傳分析以及相關(guān)性分析等得出該F1群體9個(gè)表型性狀的變異特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 月季表型性狀的變異分析

利用SPSS 24.0對花朵直徑、花冠面積、花瓣數(shù)量、花瓣長、花瓣寬、花瓣長寬比、葉片長、葉片寬以及葉片長寬比9個(gè)性狀進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析(表3)。結(jié)果顯示，整個(gè)群體的變異系數(shù)在7.33%～68.08%，證明群體內(nèi)表型差異幅度大?；ò陻?shù)量標(biāo)準(zhǔn)差為19.29，變異系數(shù)達(dá)到68.08%，證明群體間在這個(gè)性狀上的差異顯著?；ü诿娣e變異系數(shù)達(dá)到31.58%，證明群體里花冠大小差異明顯；花瓣長、花瓣寬、葉長和葉寬的變異系數(shù)明顯大于花瓣長寬比和葉片長寬比，證明該群體花瓣和葉片在大小上有所差異，但花瓣形態(tài)和葉型較為穩(wěn)定。

表3 F1表型性狀統(tǒng)計(jì)

對F1代群體表型性狀進(jìn)行頻數(shù)分布分析(圖4)，9個(gè)表型性狀都呈現(xiàn)較為突出的單峰分布，接近正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀的特點(diǎn)，其中花朵直徑、花瓣長、花瓣寬以及葉長和葉寬的偏度絕對值較接近0，證明這幾個(gè)表型性狀分布較為均勻；花冠面積、花瓣長寬比、葉長、葉寬以及葉片長寬比的峰度絕對值較小，證明這幾個(gè)性狀與正態(tài)曲線擬合性更好；花瓣數(shù)量的偏度以及峰度絕對值大于1，呈現(xiàn)出明顯正偏性和極端性。

2.2 月季表型性狀遺傳分析

對F1群體9個(gè)表型性狀與親本進(jìn)行比較分析(表4)，F(xiàn)1代群體中花瓣數(shù)量和葉片長寬比的均值明顯小于中親值，其余7個(gè)性狀的均值與中親值的比值接近100%。從總體上看，雜交后代分離廣泛，各個(gè)性狀均出現(xiàn)小于低親和大于高親的超親個(gè)體。其中花冠面積在雙親之間的子代比例達(dá)到92.93%；花朵直徑、花瓣數(shù)量、花瓣長、花瓣寬、葉長、葉寬六個(gè)性狀在雙親之間的子代約占整體80.00%，花朵直徑小于低親的個(gè)體約為大于高親的2倍，葉寬大于高親的個(gè)體遠(yuǎn)多于小于低親的個(gè)體；花瓣長寬比介于雙親之間的個(gè)體只占整體10.33%，大于高親的個(gè)體達(dá)到65.76%，呈現(xiàn)花瓣形狀更狹長的趨勢；葉片長寬比介于雙親的個(gè)體也較少，73.91%個(gè)體小于低親，呈現(xiàn)雜交后代葉片形狀更圓的趨勢。

2.3 月季表型性狀頻率分析

2.3.1 雄蕊瓣化

母本‘云蒸霞蔚’和父本‘太陽城’均存在不同程度的雄蕊瓣化，在184株F1代群體中，71%子代發(fā)生雄蕊瓣化，29%子代未發(fā)生雄蕊瓣化，即瓣化：未瓣化約為3:1(圖5)。由此可見，瓣化在雜交后代中的發(fā)生較為普遍，但仍存在約1/4的單株不同于親本，未發(fā)生雄蕊的瓣化，表明在瓣化性狀上，雜交后代存在較為明顯的差異性。其中重瓣花約占整個(gè)群體1/2；半重瓣花約達(dá)到1/4；千重瓣花和單瓣花比例較少，各占整個(gè)群體的1/8，即四個(gè)階段的比例為單瓣花∶半重瓣花∶重瓣花∶千重瓣花=4∶2∶1∶1(圖6)。

圖4 F1代群體表型性狀頻數(shù)分布圖Fig.4 Histogram of frequency distribution about the phenotypic traits of F1 population

表型性狀Phenotypic trait親本ParentsF1代群體與親本比較Comparison among F1 population and parents(%)♀♂中親值PMid-parents均值/中親值X/P小于低親Less than the low parent雙親之間Between the parents大于高親Greater than the high parent花朵直徑Corolla diameter(mm)75.6752.7664.2197.2919.5770.1110.33花冠面積Flower area(cm2)14.494.619.55100.631.6392.935.43花瓣數(shù)量Petal numbers(number)11.0053.0032.0088.5313.0476.6310.33花瓣長Petal length(mm)41.1225.6233.37102.033.8087.508.70花瓣寬Petal width(mm)41.1025.9733.5498.766.5284.788.70花瓣長寬比Length-width ratio of petal1.000.990.99103.6723.9110.3365.76葉長Leaf length(mm)60.5332.4646.50101.4110.8778.8010.33葉寬Leaf width(mm)33.7614.5624.16119.741.6375.5422.83葉片長寬比Length-width ratio of leaf1.792.232.0182.5473.9124.461.63

2.3.2 萼片附屬物

母本和父本在萼片上附著有毛，184株F1代群體中，萼片附屬物這一性狀發(fā)生了分離，其中與親本一樣附著有毛的株數(shù)為106株，占雜交群體的一半以上；其次是萼片上無附屬物，株數(shù)為35株，約占群體的1/5；另外還有15.76%萼片附著有大刺，7.61%萼片附著有小刺，4種性狀分離比為有毛∶無附屬物∶大刺∶小刺=15∶5∶4∶2(表5)。

表5F1代萼片附屬物分布分析

Table5ThedistributionofsepalsappendagesinF1population

親本萼片附屬物Sepals appendages of parentsF1代群體萼片附屬物Sepals appendages of F1 population頻率Frequency(%)♀♂平均值Mean標(biāo)準(zhǔn)差Standard deviation方差Variance0123111.190.930.8719.0257.617.6115.76

圖5 F1代瓣化情況Fig.5 The petalody of F1 population

表型性狀Phenotypic trait花瓣寬Petal width花瓣長寬比length-width ratio of petal花瓣數(shù)量Petal numbers花朵直徑Corolla diameter花冠面積Flower area葉長Leaf length葉寬Leaf width葉片長寬比Length-width ratio of leaf花瓣長Petal length0.889**0.095-0.0420.774**0.0610.147*0.182*-0.111花瓣寬Petal width-0.363**0.0270.636**0.0350.1140.112-0.039花瓣長寬比Length-width ratio of petal-0.1290.181*0.0330.0350.113-0.143花瓣數(shù)量Petal numbers-0.0140.080-0.113-0.1090.015花朵直徑Corolla diameter0.0910.1100.185*-0.166*花冠面積Flower area-0.083-0.044-0.076葉長Leaf length0.865**0.001葉寬Leaf width-0.487**

**P<0.01；*P<0.05

2.4 花部與葉部性狀相關(guān)性分析

分析花部7個(gè)性狀和葉片3個(gè)性狀之間的相關(guān)性(表6)?；ò陻?shù)量、花冠面積與其他性狀的相關(guān)性較低，花朵直徑分別與花瓣長和寬呈顯著正相關(guān)關(guān)系，證明花瓣長、花瓣寬影響花朵直徑，但未表現(xiàn)出對花瓣數(shù)量以及花冠面積的影響?；ò陮捙c花瓣長呈顯著正相關(guān)，與花瓣長寬比呈顯著負(fù)相關(guān)。葉寬與葉長呈顯著正相關(guān)，與葉片長寬比呈顯著負(fù)相關(guān)，與花瓣情況類似，證明葉片和花瓣的長寬比受其寬度影響更大；花部與葉部各個(gè)性狀相關(guān)性不顯著，只有花瓣長分別與葉長和葉寬存在弱的正相關(guān)關(guān)系以及花朵直徑與葉寬和葉片長寬比存在弱相關(guān)性。

3 討論

觀賞植物的表型性狀由其基因型和環(huán)境共同作用[15]。植物的大部分性狀都是數(shù)量性狀，掌握數(shù)量性狀的遺傳規(guī)律是育種工作的基礎(chǔ)[16]。通過雜交可以使后代性狀發(fā)生廣泛分離[9]，建立一個(gè)分離群體是開展數(shù)量性狀位點(diǎn)的定位分析的重要方式之一。對生長于同一環(huán)境中的雜交群體的表型性狀進(jìn)行系統(tǒng)測定和分析，對于研究觀賞性狀的遺傳規(guī)律、探索該性狀表現(xiàn)型與基因型的關(guān)聯(lián)性以及開展后續(xù)目標(biāo)育種具有重要意義[17]。李宗艷等[18]通過對黃牡丹12個(gè)形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行觀測，發(fā)現(xiàn)花部形態(tài)變異較葉部大，且萼片的變異系數(shù)最大。本研究184株F1代群體中，各性狀變異系數(shù)在7.33%～68.08%，證明群體內(nèi)表型差異大，遺傳多樣性豐富。其中花瓣數(shù)量和花冠面積變異系數(shù)較高，但是花瓣形態(tài)變異較葉部小。花瓣和葉片長寬比的變異程度明顯小于花瓣和葉片各自長寬，證明花瓣和葉片大小受環(huán)境影響較大，但形狀較為穩(wěn)定。對各性狀進(jìn)行遺傳分析，雜交后代大部分性狀介于親本之間，但是也均出現(xiàn)小于低親和大于高親的個(gè)體，體現(xiàn)出雜交優(yōu)勢。

賀丹等[19]對尾葉紫薇(Lagerstroemiacaudata)與紫薇(L.indica) F1代群體主要表型性狀的研究表明葉長、葉寬與葉面積呈極顯著正相關(guān)，認(rèn)為性狀的相互關(guān)聯(lián)是由控制該性狀的QTLs相互關(guān)聯(lián)造成或者由某個(gè)QTL的一因多效所引起。周俐宏等[20]對現(xiàn)代月季表型性狀進(jìn)行相關(guān)性分析并和SSR標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，成功的找到了與現(xiàn)代月季6 個(gè)表型性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記。其中葉長、葉寬、花徑兩兩間呈極顯著相關(guān)。由于月季花部表型直接影響觀賞效果，本研究除了葉長、葉寬外，選取花部5個(gè)代表性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)花朵直徑分別與花瓣長和寬顯著正相關(guān)，與葉寬存在弱的正相關(guān)關(guān)系?；ò旰腿~片各自的長、寬和長寬比三個(gè)性狀之間的相關(guān)性相似，證明長寬比受其寬度影響更大。性狀間相關(guān)性的研究可以輔助提前選擇[21]，有利于縮短育種時(shí)間，加快育種進(jìn)程。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，花朵直徑和花冠面積未表現(xiàn)出相關(guān)性。另外，花朵直徑在群體中的變異系數(shù)為18.34%，花冠面積在群體中的變異系數(shù)高達(dá)31.58%，同樣是描述花冠俯視面大小的兩個(gè)指標(biāo)，變異系數(shù)相差很大，證明花朵直徑所包含的花部的信息少于花冠面積，所以呈現(xiàn)花朵直徑的變異系數(shù)低于花冠面積的結(jié)果。由此推測本研究中所測的葉長和葉寬所代表的葉部信息有限，葉面積等其他葉部性狀的測量可以使葉部信息更完善[22]。目前，由于一維指標(biāo)測量起來更加容易，研究者對月季花冠大小傾向于選擇一維的花朵直徑、花瓣長、花瓣寬等性狀作為指標(biāo)；相關(guān)研究表明，回歸方程法可以滿足葉面積連續(xù)測定的需要，數(shù)據(jù)精度較高[23]。同樣的方式也可以應(yīng)用到其他植物花冠面積、葉面積的測量當(dāng)中[24]，建立花瓣長、花瓣寬、花朵直徑、花瓣數(shù)量等單因子或多因子的花冠面積回歸方程以及葉長、葉寬的葉面積回歸方程，可以更準(zhǔn)確代表花部信息，便于探索各性狀遺傳和相關(guān)顯著性等關(guān)系。

自然界有豐富多彩的重瓣觀賞植物，其起源大致包括積累起源、苞片起源、雌雄蕊起源、臺(tái)閣起源、重復(fù)起源和花序起源6種方式[25]。本研究的F1群體表現(xiàn)出了明顯的雄蕊瓣化現(xiàn)象，驗(yàn)證了月季重瓣性來源于雄蕊瓣化。Serrato[26]對萬壽菊(Tageteserecta)瓣性研究也表明，單瓣花的后代是單瓣或復(fù)瓣；重瓣花的后代中單瓣、復(fù)瓣和重瓣均有分布。黃秀強(qiáng)[27]等用單瓣美洲黃蓮(Nelumbonucifera)與單瓣蓮雜交，其種間雜種仍為單瓣，與重瓣蓮品種雜交，其種間雜種為半重瓣或重瓣，據(jù)此認(rèn)為蓮屬花型并非簡單的孟德爾遺傳，而是由多基因控制。于超[1]檢測到了月季雜交群體7個(gè)與花瓣數(shù)量相關(guān)聯(lián)的QTLs，證明花瓣數(shù)量這一性狀為數(shù)量性狀，并可能存在主效基因控制。上述情況也在本研究中得到驗(yàn)證，該群體在花瓣數(shù)量這一性狀上分離程度高，呈正態(tài)分布，證明月季的重瓣性表現(xiàn)為由多基因控制的數(shù)量性狀，通過多代雜交選育，后代往往可能出現(xiàn)超過親代花瓣數(shù)量的品種，此發(fā)現(xiàn)對于指導(dǎo)月季重瓣花育種和探索花發(fā)育的遺傳調(diào)控因子具有參考價(jià)值。