龔 娜，劉國(guó)麗，陳 珣，曹 君，楊 鎮(zhèn)，張 敏，馬世宇，

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161；2.葫蘆島農(nóng)函大玄宇食用菌野馴繁育有限公司，遼寧 興城 125125）

平菇（Pleurotus ostreatus） 是全球栽培面積和消費(fèi)量最大的食用菌之一[1]，由于近年來我國(guó)平菇生產(chǎn)規(guī)模的逐步擴(kuò)大，使得栽培平菇的基質(zhì)日趨緊張，玉米芯資源豐富，可替代木屑，且其價(jià)格較棉籽殼、木屑便宜，是栽培平菇主要培養(yǎng)原料之一[2-3]。玉米芯易于就地取材，可實(shí)現(xiàn)廢棄物利用，并且含有豐富的蛋白質(zhì)、糖和纖維素等[4]。平菇菌絲在生長(zhǎng)發(fā)育中通過分泌多種胞外酶將基質(zhì)中的纖維素、木質(zhì)素等水解成小分子物質(zhì)作為主要碳素營(yíng)養(yǎng)[5]，其生長(zhǎng)分化與分泌胞外纖維素酶的能力大小密切相關(guān)[6]。

不同平菇菌株對(duì)原料的利用和轉(zhuǎn)化效果有很大差異，菌種是制約食用菌生產(chǎn)的關(guān)鍵因素[7]，不同菌株在玉米芯基質(zhì)上的分解能力不同，成為平菇基質(zhì)利用的主要障礙。傳統(tǒng)的菌株篩選方法是利用栽培試驗(yàn)，周期長(zhǎng)，所需空間大，操作過程復(fù)雜，成本高[8]。本研究采用平皿法、剛果紅杯碟快速篩選法對(duì)18株平菇菌株在以玉米芯為營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)和降解效果的篩選，以期篩選出適于玉米芯栽培的高產(chǎn)胞外纖維素酶的優(yōu)勢(shì)平菇菌株，為平菇遺傳育種篩選高酶活菌株提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)提高平菇綜合生產(chǎn)能力起到重要作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所試驗(yàn)室引種保存的18個(gè)平菇菌株，如表1所示。

表1 供試菌株Tab.1 Strains of Pleurotus ostreatus used in the study

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖2%、馬鈴薯20%、瓊脂1.5%，采用自來水配置，pH 7.0。

玉米芯培養(yǎng)基：玉米芯5%、瓊脂1.5%，采用自來水配置，pH 7.0。

剛果紅-羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基[9]：羧甲基纖維素鈉 2.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.88 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、蛋白胨 2.0 g·L-1、剛果紅 0.25 g·L-1、瓊脂粉15 g·L-1，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)量和統(tǒng)計(jì)

菌種活化：取出保藏在冰箱中的母種，在超凈工作臺(tái)上接種試管斜面PDA培養(yǎng)基，每個(gè)菌株接種3支，23℃培養(yǎng)5 d。

原種的擴(kuò)大培養(yǎng)：6 d后選取生長(zhǎng)狀況最好的活化菌株，在超凈工作臺(tái)上接種到PDA平板正中央，以保證菌落邊緣連續(xù)，菌絲生長(zhǎng)均勻。23℃培養(yǎng)8 d，每個(gè)菌株3次重復(fù)。

打孔接種：培養(yǎng)8 d后選取菌絲生長(zhǎng)一致的平板，在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌打孔器在與平板中央距離相同位置上打孔，接種到玉米芯培養(yǎng)基平板中央，23℃培養(yǎng)8 d，每個(gè)菌株3次重復(fù)。

剛果紅染色法[10-12]：用打孔器（直徑約5 mm）將單菌落接種至CMC-Na平板培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)8 d，然后觀察變色圈的大小，用游標(biāo)卡尺測(cè)菌落直徑d（mm） 和變色圈直徑D（mm）。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定：接種第3天開始，每隔1 d通過十字劃線測(cè)定菌落直徑，精確到毫米，記錄時(shí)間和生長(zhǎng)量，每個(gè)菌株3次重復(fù)。

菌絲生長(zhǎng)指數(shù)[13]：菌絲生長(zhǎng)指數(shù)為菌絲長(zhǎng)勢(shì)評(píng)分乘以菌絲生長(zhǎng)速率（mm·d-1）。

菌落直徑：培養(yǎng)7 d之后測(cè)量的菌落直徑。

菌絲長(zhǎng)勢(shì)：設(shè)定5為旺盛，4為較旺盛，3為長(zhǎng)勢(shì)一般，2為長(zhǎng)勢(shì)較差，1為長(zhǎng)勢(shì)最差。

酶指數(shù)采用EI表示，EI=D/d。

采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米芯培養(yǎng)基對(duì)不同平菇菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

玉米芯培養(yǎng)基對(duì)不同平菇菌株菌絲生長(zhǎng)的影響見表2。

由表2可見，18種平菇在玉米芯培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，但其菌絲生長(zhǎng)速率、長(zhǎng)勢(shì)評(píng)分、菌落直徑、菌絲生長(zhǎng)指數(shù)間有較大的差異，其中10號(hào)菌絲濃密、粗壯、生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)速率、菌落直徑、生長(zhǎng)指數(shù)最大。菌株長(zhǎng)勢(shì)情況，10號(hào)、2號(hào)、12號(hào)生長(zhǎng)旺盛，菌株生長(zhǎng)速度最快，5號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、15號(hào)、18號(hào)菌株次之，較旺盛，1號(hào)、4號(hào)、14號(hào)、16號(hào)、17號(hào)長(zhǎng)勢(shì)一般、生長(zhǎng)速度慢，13號(hào)長(zhǎng)勢(shì)較差，3號(hào)、7號(hào)、11號(hào)長(zhǎng)勢(shì)最差。綜合各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)得到平菇在玉米芯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)的排序?yàn)?0號(hào)＞2號(hào)＞12號(hào)＞15號(hào)＞6號(hào)＞9號(hào)＞18號(hào)＞5號(hào)＞8號(hào)＞1號(hào)＞4號(hào)＞16號(hào)＞14號(hào)＞17號(hào)＞13號(hào)＞7號(hào)＞3號(hào)＞11號(hào)。

2.2 不同平菇菌株在玉米芯培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)曲線

不同平菇菌株在玉米芯培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)曲線見圖1。

表2 玉米芯培養(yǎng)基對(duì)不同平菇菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effect of corncob medium on mycelium growth of Pleurotus ostreatus

圖1 平菇在玉米芯培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Pleurotus ostreatus on the corncob medium

由圖1可見，18種平菇菌株在玉米芯培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)曲線可以分為5組：10號(hào)、2號(hào)、12號(hào)菌絲生長(zhǎng)曲線為一組（第1組），5號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、15號(hào)、18號(hào)菌絲生長(zhǎng)曲線為1組（第2組），1號(hào)、4號(hào)、14號(hào)、16號(hào)、17號(hào)菌絲生長(zhǎng)曲線為1組（第3組），13號(hào)菌絲生長(zhǎng)曲線為1組（第4組），3號(hào)、7號(hào)、11號(hào)菌絲生長(zhǎng)曲線為1組（第5組）。從菌絲生長(zhǎng)曲線的變化趨勢(shì)可見，第1組10號(hào)、2號(hào)、12號(hào)菌絲的生長(zhǎng)效果最好，菌絲萌發(fā)快，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌絲生長(zhǎng)指數(shù)呈直線上升趨勢(shì)，而且上升幅度比較大。第2組與第3組菌絲生長(zhǎng)曲線非常接近，其生長(zhǎng)明顯低于第1組，但明顯高于第4組和第5組。

2.3 剛果紅染色法快速篩選高產(chǎn)纖維素酶平菇菌株

剛果紅染色法快速篩選高產(chǎn)纖維素酶平菇菌株，結(jié)果見表3。

由表3可知，降解的羧甲基纖維素鈉不再與剛果紅結(jié)合形成紅色復(fù)合物，通過剛果紅染色法獲得其水解纖維素酶能力，結(jié)果表明平菇菌株的菌落周圍均可產(chǎn)生透明圈，均能夠顯現(xiàn)羧甲基纖維素鈉的酶活。其中10號(hào)菌株（3302）變色圈出現(xiàn)較早，變色圈更大，變色圈直徑為41.67 mm。結(jié)合酶指數(shù)可以篩選出降解效果較好的菌株為10號(hào)菌株（3302），其降解纖維素的能力最強(qiáng)。

表3 剛果紅染色法快速篩選高產(chǎn)纖維素酶平菇菌株Tab.3 Cellulose-degrading Pleurotus ostreatus screened by congo red saucer rapid screening method

3 結(jié)論與討論

平菇適應(yīng)性廣、栽培方法簡(jiǎn)單，多種作物秸稈均可作為基質(zhì)生產(chǎn)平菇[14-16]。隨著栽培面積的增加，棉籽殼、木屑資源緊缺，容易造成“菌林矛盾”等生態(tài)環(huán)境問題，栽培成本也隨之攀升。玉米芯屬于農(nóng)業(yè)廢棄物，對(duì)于木屑較少、玉米芯較多的栽培區(qū)域，既可降低培養(yǎng)成本，又能充分利用資源，使其變廢為寶，提高經(jīng)濟(jì)效益。食用菌胞外酶活性的變化因菌種和酶的不同而有所不同，但其變化也有一定的規(guī)律性，并且能夠較直接反映出食用菌對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)的降解情況[17]，平菇整個(gè)生長(zhǎng)周期和酶活的變化趨勢(shì)與菌絲生長(zhǎng)勢(shì)基本相同[18]。目前，我國(guó)已有對(duì)平菇營(yíng)養(yǎng)生理的研究，但對(duì)平菇多種不同菌株胞外纖維素酶對(duì)比鮮有報(bào)道。篩選高效纖維素降解菌株是高效利用纖維素類物質(zhì)的關(guān)鍵，纖維素酶活力是評(píng)價(jià)菌株降解纖維素能力的重要指標(biāo)[19]。優(yōu)勢(shì)平菇菌株是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，能極大地提升栽培效益。以栽培的方式設(shè)計(jì)玉米芯含量不同的培養(yǎng)料配方的研究方法受到培養(yǎng)條件的限制，需要的空間大，周期長(zhǎng)。本研究以玉米芯為營(yíng)養(yǎng)源，采用平板法快速篩選適于玉米芯栽培的平菇菌株。結(jié)果表明，在含玉米芯的培養(yǎng)基上，18株平菇菌株菌絲均能生長(zhǎng)，但是菌絲生長(zhǎng)曲線差異較大，菌株3302、9408和抗病2號(hào)菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，3302長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲生長(zhǎng)速率和菌絲生長(zhǎng)指數(shù)分別為11.28 mm·d-1和56.39，變色圈最大，直徑為41.67 mm。今后可在本試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)所篩選出的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行代料栽培，進(jìn)行培養(yǎng)料與子實(shí)體的相關(guān)性的研究等，此試驗(yàn)也為今后選育適合玉米芯栽培的平菇菌株提供了親本菌株參考。