蘭玉菲，叢倩倩，崔 曉

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 泰安 271000）

金針菇[Flammulina velutipes（Fr.）Singer]是我國重要的栽培食用菌之一，其營養(yǎng)豐富、味道鮮美，尤其富含賴氨酸和精氨酸，被稱為“益智菇”[1-2]，深受人們喜愛。

近年來隨著金針菇種植規(guī)模的逐年增大，蛛網(wǎng)病發(fā)生和危害呈加重趨勢(shì)，已成為金針菇生產(chǎn)中污染嚴(yán)重的真菌病害之一。在工廠化周年栽培廠房內(nèi)和農(nóng)戶菇棚中子實(shí)體的發(fā)育時(shí)期均可發(fā)生。該病一旦發(fā)生，蔓延迅速，毀滅性強(qiáng)，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量孢子，給金針菇種植企業(yè)和菇農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了明確引起該病害的病原，筆者對(duì)病原菌進(jìn)行了分離和鑒定，明確了病原菌的分類地位，以期為該病害的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌采集

發(fā)病樣品采自濟(jì)寧市金鄉(xiāng)縣金針菇菇棚內(nèi)。

1.2 病原菌的分離純化

無菌環(huán)境下，將采集的感病子實(shí)體的病健交界處組織接種于PDA培養(yǎng)基（涂布有2滴～3滴25%乳酸）上，黑暗培養(yǎng)。菌絲萌發(fā)后進(jìn)行3次純化得到純培養(yǎng)，編號(hào)為JN，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測(cè)定

將JN菌株活化培養(yǎng)10 d～12 d后，用無菌水制備孢子懸浮液（每毫升1×106），采用噴霧法接種，定期觀察發(fā)病情況。從接種發(fā)病的金針菇上重新分離病原菌，確定是否為同一病原菌。以無菌水噴灑到健康子實(shí)體為對(duì)照[3-4]。

1.4 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察并記錄病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征、菌落顏色變化等。顯微觀察菌絲特征和分支情況，孢子形態(tài)和大小等并拍照。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

制備病原菌菌絲體并提取其基因組總DNA，具體方法參照文獻(xiàn)[5]；利用ITS1/ITS4真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增的通用引物[6]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和程序參照文獻(xiàn) [5]；將PCR產(chǎn)物測(cè)序后所得到的DNA序列輸入GenBank進(jìn)行Blast檢索，利用DNAMAN、MEGA等軟件對(duì)該病原菌ITS序列與GenBank中收錄分離物的ITS序列進(jìn)行比較和分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀特征

病原菌對(duì)金針菇子實(shí)體的為害癥狀見圖1。

圖1 病原菌對(duì)金針菇子實(shí)體的為害癥狀Fig.1 Symptom of cobweb disease on Flammulina velutipes fruiting bodies

病害癥狀如圖1A和圖1B，主要癥狀表現(xiàn)為在金針菇催蕾期，菇蕾上出現(xiàn)肉眼可見的白色絮狀物，隨著子實(shí)體的生長發(fā)育，白色絮狀物將整個(gè)子實(shí)體覆蓋住，并產(chǎn)生大量的分生孢子，最后導(dǎo)致子實(shí)體倒伏、腐爛。

2.2 病原菌致病性測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的病原菌接種到健康金針菇子實(shí)體上發(fā)病后的癥狀（圖1C和圖1D） 與栽培條件下采集的病害樣品癥狀完全一致（圖1A和圖1B）；而對(duì)照組子實(shí)體未表現(xiàn)出病害癥狀。從人工接種發(fā)病的金針菇子實(shí)體上再次分離得到病原菌，且性狀與接種物相同。證明菌株JN為金針菇蛛網(wǎng)病的病原菌。

2.3 病原菌分離和形態(tài)特征觀察

菌株JN的菌落和形態(tài)特征見圖2。

圖2 菌株JN的菌落和形態(tài)特征Fig.2 Colony and morphology of JN strain

菌株JN在PDA培養(yǎng)基上初期菌絲潔白濃密，菌落邊緣整齊，后期有粉狀分生孢子產(chǎn)生；菌絲培養(yǎng)后期不產(chǎn)生色素，菌落背面無色（圖2A～2C）。病原菌絲為有隔菌絲，在菌絲上形成分生孢子梗，分生孢子梗分枝并輪生，在小梗頂端形成分生孢子，分生孢子呈橢圓形，單細(xì)胞或雙細(xì)胞，大小為（12.4～16.8）μm× （6.4～8.6）μm，無色透明 （圖 2D）。

2.4 病原菌ITS的序列測(cè)定與分析

用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的相關(guān)Hypomyces屬菌株和ITS序列以及構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹分別見表1和圖3。

以病原菌總DNA為模板，PCR擴(kuò)增后得到長度約為600 bp的目的片段。測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物長度為574 bp（GenBank登錄號(hào)為MH607599），其中包括18S rDNA基因序列21 bp、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1） 176 bp、5.8S編碼序列157 bp、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 2（ITS2）200 bp和 28S rDNA 20 bp。經(jīng)與 Gen-Bank中相關(guān)基因序列（表1） 進(jìn)行同源性比對(duì)，菌株JN與GenBank中引起韓國斑玉蕈蛛網(wǎng)病的病原Hypomyces aurantius（AB591044） 同源性最高，核苷酸一致率為99.81%。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)菌株J N與GenBank中來自于不同國家的H.aurantius的6個(gè)分離物聚為一簇，組內(nèi)核苷酸一致率為98.26%～99.81%，而與枝葡孢屬（Cladobotryum） 其他種 （Cladobotryum dendroides、Cladobotryum mycophilum和Cladobotryum semicirculare） 的核苷酸一致率為87.72%～90.61%（如圖3所示）。結(jié)合形態(tài)特征，將JN菌株鑒定為金黃菌寄生H.aurantius（無性型Cladobotryum varium）。

表1 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的相關(guān)Hypomyces屬菌株和ITS序列登錄號(hào)Tab.1 Related strains of Hypomyces used in phylogenetic analysis and their ITSsequence accession number

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITSsequences and constructed using the neighbor-joining method

3 討論

菌寄生屬（Hypomyces） 建立于1860年，隸屬于子囊菌門 （Ascomycota） 糞殼菌綱 （Sordariomycetes） 肉座菌目 （Hypocreales） 肉座菌科（Hypocreaceae），該屬真菌具有重寄生性，通常生長于多孔菌、牛肝菌、傘菌和盤菌等真菌的子實(shí)體上，無性階段主要包括枝葡孢屬（CladobotryumNees）、瘤孢屬（SepedoniumLink）、疣孢霉屬（MycogoneLink） 等[7-8]。

本研究對(duì)山東省金針菇病害的病原學(xué)進(jìn)行了研究，通過分子鑒定并結(jié)合形態(tài)特征，證明該病害為金針菇蛛網(wǎng)病，病原為金黃菌寄生菌Hypomyces aurantius（Pers.）Fuckel（無性型：Cladobotryum variumNees）。

在我國Teng[9]首次報(bào)道了該病菌；蔡為明等[10]報(bào)道Cladobotryum varium引起金針菇軟腐??；張琪輝等[11]報(bào)道該病菌引起斑玉蕈蛛網(wǎng)病并造成嚴(yán)重?fù)p失；Chang等[4，12]報(bào)道在韓國雙孢蘑菇和斑玉蕈工廠中也發(fā)現(xiàn)了該病菌。蛛網(wǎng)病是由Cladobotryum屬/Hypomyces屬真菌侵染引起的食用菌病害，該病可危害多種食用菌，在歐洲、美洲和亞洲等地區(qū)均有報(bào)道[11]，筆者首次在中國發(fā)現(xiàn)Cladobotryum mycophilum引起雙孢蘑菇蛛網(wǎng)病，并對(duì)其生物學(xué)特性、發(fā)生特點(diǎn)和防控技術(shù)進(jìn)行了研究[13-15]。本研究首次利用分子生物學(xué)手段對(duì)山東省金針菇蛛網(wǎng)病病原進(jìn)行了鑒定，明確了其病原，為該病害的防治奠定理論基礎(chǔ)。關(guān)于金針菇蛛網(wǎng)病病原菌的生物學(xué)特性、發(fā)生特點(diǎn)和防控技術(shù)還有待于進(jìn)一步研究。