戴曦 宋琦 梁麗嫻

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（四川瀘州646000）；2澳門科技大學(xué)中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室/澳門藥物及健康應(yīng)用研究院（澳門特別行政區(qū)999078）

在世界范圍內(nèi)每年大約有1 600 多萬例患者死于腫瘤，其中亞洲和歐洲就貢獻(xiàn)了約73%的人口，中國大約占25%［1-2］。美國每年大約有168 萬新發(fā)癌癥病例和59 萬因癌癥導(dǎo)致的死亡病例，緊隨心血管疾病之后，癌癥亦成為美國第二位死亡原因［3］。在歐洲，有數(shù)據(jù)報道每年癌癥的發(fā)病率和病死率分別是345 萬和175 萬，女性乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌是歐洲發(fā)病率最高的4 種癌癥類型［4］。由此可見，腫瘤因其高發(fā)病率和高致死率，導(dǎo)致了巨大的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管有更先進(jìn)的成像、診斷技術(shù)的出現(xiàn)和不斷發(fā)展的靶向藥物，癌癥所帶來的威脅仍在與日俱增，因此，更深入探索和了解腫瘤機(jī)制，優(yōu)化診治方案是目前亟待解決的問題之一。

1 單細(xì)胞生物技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用意義

在過去，細(xì)胞個體特征與群體特征的一致性是被廣泛接受的一個概念，在這一觀點的引導(dǎo)下，學(xué)者們一直關(guān)注于腫瘤宏觀水平的研究而非腫瘤細(xì)胞個體。然而，近年的研究逐步揭示出單個細(xì)胞的個體特性是明顯有別于整體的［5-6］。腫瘤的發(fā)展是基于單個腫瘤細(xì)胞的自體擴(kuò)增、隨機(jī)突變以及自我篩選形成相對獨立的亞群，這些亞群之間又互相影響成為密不可分的整體發(fā)展［7］。在宿主環(huán)境中，惡性細(xì)胞除了將遺傳模板傳遞給下一代以外，還在適應(yīng)過程中不斷自我改造，使得遺傳信息出現(xiàn)適應(yīng)性修飾改變成為必然，其結(jié)果是組成整體的個體之間逐漸呈現(xiàn)出不同程度的差異，最終導(dǎo)致不同患者對相同治療出現(xiàn)不同應(yīng)答，治療效果千差萬別。因此將研究深入到單細(xì)胞水平，而不再固守于傳統(tǒng)的整體宏觀研究，極大提高了科研工作者對腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和患者個體性的認(rèn)識，逐漸揭示出在整個腫瘤生態(tài)體系中，腫瘤細(xì)胞個體是如何感知、回應(yīng)并適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的，并且腫瘤細(xì)胞個體的異質(zhì)性又是如何出現(xiàn)并最終影響腫瘤整體的命運［8］。成批量的分析腫瘤整體的特性僅僅是得到該細(xì)胞種群的平均數(shù)據(jù)，而那些重要的腫瘤細(xì)胞亞群信息卻被無意中隱藏了起來；相反，如果對亞群中代表性的單個細(xì)胞進(jìn)行分析，就能得到豐富而準(zhǔn)確的細(xì)節(jié)信息，了解患者個體差異，從而在腫瘤治療中指導(dǎo)臨床決策和個體化用藥，最終通過精準(zhǔn)治療使患者獲益［9］。

2 單個腫瘤細(xì)胞的分離技術(shù)研究進(jìn)展

從腫瘤患者體內(nèi)直接取得的標(biāo)本是混雜的腫瘤細(xì)胞群，或腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的混雜，運用傳統(tǒng)宏觀分析得到的結(jié)果是該細(xì)胞群平均值，必然存在干擾因素的摻雜，導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此需要從單細(xì)胞水平對腫瘤進(jìn)行，其首要前提是實現(xiàn)單個腫瘤細(xì)胞的分離。如何從腫瘤患者標(biāo)本中精確獲得高通量數(shù)據(jù)，同時在單個腫瘤細(xì)胞采集過程中細(xì)胞的遺傳生理特性不受影響是目前面臨的最大挑戰(zhàn)［10］。目前單個細(xì)胞的分離技術(shù)主要有：（1）細(xì)胞顯微操作技術(shù)。在可視下通過細(xì)胞顯微操縱器手動篩選所需細(xì)胞，可控性高。現(xiàn)亦運用于細(xì)菌篩選、人輔助生殖技術(shù)等技術(shù)領(lǐng)域［11］。（2）紅外線切割技術(shù)。將患者的腫瘤組織切片置于顯微鏡下，利用高強度激光束在可視下切割單個腫瘤細(xì)胞，切割過程不會對細(xì)胞造成任何傷害或污染，但對操作技術(shù)有較高要求［12］。（3）流式細(xì)胞術(shù)。將患者標(biāo)本中的細(xì)胞群處理后在超聲波和流體力學(xué)作用下形成有序的單個細(xì)胞隊列并快速通過激光束，細(xì)胞上被激光激發(fā)的光學(xué)信號被光學(xué)探測器捕獲，根據(jù)細(xì)胞大小、形態(tài)、自發(fā)熒光或標(biāo)記熒光、熒光標(biāo)記抗體或染色等理化性質(zhì)的不同實現(xiàn)對患者血液細(xì)胞的分選、分析、鑒定和診斷。目前只有流式細(xì)胞術(shù)真正實現(xiàn)了高通量高效能的細(xì)胞分離篩選，根據(jù)細(xì)胞類型和應(yīng)用程序的不同，細(xì)胞篩選能達(dá)到數(shù)百到數(shù)千個/秒不等，在免疫表型、細(xì)胞周期、凋亡、亞種群、腫瘤診斷等領(lǐng)域都得到了廣泛運用。但是在分選過程中細(xì)胞的生理特性受到流體壓力、激光刺激、靜電壓等因素的影響，難以利用分選細(xì)胞進(jìn)一步研究分析［13］。（4）免疫磁珠分離技術(shù)。這類技術(shù)利用特異性抗原抗體反應(yīng)將標(biāo)記有特殊抗體的磁珠目標(biāo)腫瘤細(xì)胞結(jié)合在一起，在磁場作用下與磁珠結(jié)合的腫瘤細(xì)胞被吸附實現(xiàn)單個細(xì)胞分離。這種技術(shù)已被成熟運用于臨床循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測當(dāng)中，也能避免腫瘤細(xì)胞在捕獲過程中的損傷。（5）微流體裝置。又被稱為“芯片上的實驗室”，這種生物芯片上特殊設(shè)計的通道直徑僅容少量細(xì)胞通過，通過對流體壓力的平衡調(diào)節(jié)將目標(biāo)腫瘤細(xì)胞捕獲并固定在可視區(qū)域內(nèi)，通過進(jìn)一步的處理可以實現(xiàn)在短時間內(nèi)動態(tài)觀察并測量腫瘤細(xì)胞的各項生理參數(shù)。當(dāng)前的微流體裝置實現(xiàn)了單細(xì)胞分離和分析的一體化，具有污染少、耗材少、對細(xì)胞物理損傷小等優(yōu)勢［14-15］。

3 單細(xì)胞分析技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展

腫瘤細(xì)胞在生長分裂過程中不斷累積新的突變，進(jìn)而成為不同的克隆亞型并最終形成腫瘤包塊，與之同步的是腫瘤細(xì)胞DNA 持續(xù)的損傷修復(fù)過程和基因的不斷丟失。這意味著單個腫瘤細(xì)胞之間在基因組序列及表型上存在差異，這種異質(zhì)性最終對治療和預(yù)后產(chǎn)生關(guān)鍵性的影響。對于實體腫瘤來說，細(xì)胞異質(zhì)性、分子間差異以及微環(huán)境的復(fù)雜性是臨床工作中對腫瘤進(jìn)行分類、診斷和治療的一大障礙，而單細(xì)胞水平的分析恰好解決了以上問題，通過揭示信號通路相互之間的抑制或激活關(guān)系、遺傳信息的隨機(jī)波動，讓我們真正能從單克隆水平了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲等，在分子水平上揭示腫瘤相關(guān)機(jī)制。目前技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)了單個細(xì)胞水平的基因組學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析以及蛋白組學(xué)分析，這些技術(shù)幫助我們理解單個腫瘤細(xì)胞基因表型與功能之間的關(guān)系，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性同以及宏大的遺傳多樣性［16］。

3.1 單細(xì)胞基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展 通常單個細(xì)胞的基因組DNA 含量約在pg～μg 水平，RNA 含量在pg～ng 水平，其中真正攜帶遺傳信息的mRNA 僅占10%左右，因此擴(kuò)增是單細(xì)胞基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的首要關(guān)鍵，如何減少基因片段丟失、擴(kuò)增偏倚、突變、嵌合和污染，提高擴(kuò)增效率和純度，覆蓋單細(xì)胞的全基因組是目前單細(xì)胞基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究所面臨的共同問題［17-18］。傳統(tǒng)PCR 全基因組擴(kuò)增技術(shù)（WGA）由于其原理是非線性的隨機(jī)基因配對而很容易出現(xiàn)誤差，改良的MDA 法和MALBAC 等技術(shù)更好地覆蓋了全基因組，降低了配對誤差［19］。另一方面Tang′s method、Smart-seq、STRT-seq、CEL-seq、Drop-seq、Cyto-seq 等多種技術(shù)被發(fā)明并應(yīng)用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的擴(kuò)增和分析，這些方法在轉(zhuǎn)錄完整性、定位誤差、結(jié)合特異性以及兼容性等方面各有特色，能將單個腫瘤細(xì)胞通過微滴實現(xiàn)分離包裹，在微滴中完成裂解和逆轉(zhuǎn)錄，再通過特殊設(shè)計的磁珠收集逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并進(jìn)一步分析篩選［20-23］。通過對腫瘤的基因突變檢測以及全基因測序分析，目前發(fā)現(xiàn)了更多腫瘤相關(guān)性基因突變，為臨床診治和科研提供更多方法和證據(jù)。

3.2 單細(xì)胞蛋白組學(xué)研究進(jìn)展 單細(xì)胞蛋白免疫印跡技術(shù)是利用標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)對腫瘤細(xì)胞群進(jìn)行分類篩選，或直接檢測單個腫瘤細(xì)胞中特定蛋白的表達(dá)水平。該技術(shù)實現(xiàn)了對單個腫瘤細(xì)胞的蛋白組學(xué)分析。這種方法可以將單個腫瘤細(xì)胞放進(jìn)直徑為20 μm 的凝膠微孔中原位裂解并電泳，在0.5 mm 長的凝膠上經(jīng)過抗原抗體反應(yīng)和發(fā)光顯像，單個細(xì)胞的目標(biāo)蛋白表達(dá)水平就能被檢測到［24-25］。通過對單細(xì)胞分析技術(shù)的運用，BENDALL 同時檢測了人骨髓中單細(xì)胞的34 項參數(shù)，并由此繪制出藥物反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞信號應(yīng)答圖譜［26-27］；有些微流體裝置還實現(xiàn)了100%純度的高通量篩選分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并利用該技術(shù)完成了臨床循環(huán)腫瘤標(biāo)本的EGFR 突變分析［28］?？梢哉f，單細(xì)胞分析技術(shù)正讓我們面臨一場腫瘤治療的新革命。

4 微流體單細(xì)胞生物芯片分析儀在耐藥肺癌患者中的臨床應(yīng)用

化療仍然是晚期肺癌患者的首選治療方案，然而化療藥物的耐藥性，尤其是多重耐藥（multidrug resistance，MDR）往往難以避免［29］。耐藥的機(jī)制復(fù)雜，一方面是由于腫瘤細(xì)胞膜藥物轉(zhuǎn)運蛋白的過表達(dá)或過度激活，這類ATP鏈接轉(zhuǎn)運蛋白（P-gp，MRP1）具有跨膜域結(jié)構(gòu)，扮演著腫瘤細(xì)胞保護(hù)者角色，將大量藥物轉(zhuǎn)運出細(xì)胞導(dǎo)致臨床耐藥和治療失?。?0-32］。另一方面則是由于腫瘤細(xì)胞藥物解毒酶系統(tǒng)的過表達(dá)。以谷硫磷轉(zhuǎn)移酶為代表的這類酶系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞中顯著高表達(dá)，參與異種生物的解毒，導(dǎo)致胞內(nèi)藥物降解，降低細(xì)胞毒性，與腫瘤治療反應(yīng)密切相關(guān)［33］。另外，研究發(fā)現(xiàn)了許多非編碼小分子RNA 通過突變基因的表達(dá)參與表觀遺傳調(diào)控，從而導(dǎo)致MDR［34］。在臨床診治中檢測患者是否耐藥，提前根據(jù)患者腫瘤細(xì)胞特征選擇敏感性化療藥物以避免無效治療、減輕患者痛苦，是治療肺癌的關(guān)鍵課題之一，微流體單細(xì)胞生物芯片分析技術(shù)恰好能解決這個問題。

微流體單細(xì)胞生物芯片分析技術(shù)是利用微流控芯片裝置在顯微鏡下捕獲單個細(xì)胞并對其進(jìn)行觀察檢測的新技術(shù)，它包括一個觀察裝置（帶有激光的顯微鏡，同時能實現(xiàn)將光學(xué)信號轉(zhuǎn)換并傳遞到計算機(jī)），3D 打印微流控生物芯片（細(xì)胞流控和捕獲平臺）以及數(shù)據(jù)分析軟件。其微流控芯片同時設(shè)計有多個通道控制藥物的進(jìn)出，通過檢測標(biāo)記在藥物上的熒光信號并將信號傳輸?shù)椒治鲕浖羞M(jìn)行分析，借此了解藥物與目標(biāo)細(xì)胞的相互作用。首先，筆者采用磁珠分選技術(shù)提取患者血液、胸水等標(biāo)本中的肺癌細(xì)胞，通過腫瘤細(xì)胞計數(shù)評估患者病情。緊接著這些篩選分離得到的細(xì)胞被固定在微流控芯片的特定位置，通過檢測目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)藥物聚集水平就可以預(yù)先評估該患者對藥物的敏感性如何，從而指導(dǎo)個體化臨床化療方案的制定。其次，微流體單細(xì)胞生物芯片分析儀也是本實驗室篩選新的有效抗癌藥物的良好工具，甚至是篩選能夠逆轉(zhuǎn)肺癌MDR 的新的藥物。這些研究借助單細(xì)胞分析平臺揭開了更多肺癌的面具，使得臨床轉(zhuǎn)化獲益。

5 單細(xì)胞分析技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用挑戰(zhàn)與展望

單細(xì)胞分析技術(shù)作為快速發(fā)展的前沿科技，在生命科學(xué)發(fā)展中扮演了極為重要的角色，它揭示了細(xì)胞個體是如何感知、回應(yīng)并適應(yīng)群體并最終決定群體的命運，幫助我們深入了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，評估患者病情，指導(dǎo)臨床治療。當(dāng)然，這項技術(shù)在許多方面還有很大的提升空間，例如高通量的篩選細(xì)胞同時避免污染減少細(xì)胞損傷；提高基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)擴(kuò)增的完整性同時減少配對偏倚；根據(jù)個體的異質(zhì)性更好地評估群體發(fā)展趨勢等等。單細(xì)胞分析技術(shù)是近年來關(guān)注的焦點，我們有理由相信這一領(lǐng)域正在蓬勃發(fā)展并將促進(jìn)更多相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)的發(fā)展，最終推動醫(yī)療的進(jìn)步。