劉娜，翁閃凡，陳姝，葉國(guó)麟

(1 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山528000；2 佛山市第一人民醫(yī)院)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居女性癌癥死亡原因的的首位[1]。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌預(yù)后不良的主要原因。但目前乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不完全清楚[2]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸，主要通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA的3′UTR區(qū)，參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過(guò)調(diào)控癌基因或抑癌基因表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程[4～6]。miR-101-3p是miR-101家族的成員之一，已有研究證實(shí)，miR-101-3p表達(dá)在肺癌、卵巢癌、胃癌等腫瘤組織中明顯下調(diào)，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[7～11]。Rac1是Rho家族的重要成員之一，可參與細(xì)胞有絲分裂、骨架重排等生物學(xué)過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織中Rac1高表達(dá)，且其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[12，13]。TargetScan軟件預(yù)測(cè)，Rac1是miR-101-3p的靶向調(diào)控基因。因此，我們推測(cè)miR-101-3p可能通過(guò)靶向調(diào)控Rac1促進(jìn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。為此，2016年7月～2018年7月，我們進(jìn)行了如下研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435及正常乳腺細(xì)胞株HBL-100，購(gòu)自上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所。miR-101 mimics、miR-101抑制物及其陰性對(duì)照物，美國(guó)Ambion公司。所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。Mastercycler Ep Realplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。野生型與突變型Rac1熒光素酶報(bào)告基因載體，美國(guó)Introvigen公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒，日本TaKaRa株式會(huì)社；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，北京艾然生物科技有限公司。Rac1、MMP-2、GAPDH一抗及HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435及HBL-100細(xì)胞37 ℃快速解凍，然后將MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435細(xì)胞接種于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，HBL-100細(xì)胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合80%以上時(shí)，按1∶3傳代。取傳2代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 乳腺癌細(xì)胞篩選 收集傳2代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435及HBL-100細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)鑒定，A260/A280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，按SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-101-3p上游引物5′-ACGGGCGAGCTCAGTACTGTG-3′，下游引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGCTA-3′；GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游引物5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。選擇miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量最低的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 取miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量最低的乳腺癌細(xì)胞，接種于6孔板，每孔1×105個(gè)。隨機(jī)分為對(duì)照組、miR-101-3p抑制物組和miR-101-3p mimics組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)融合30%左右時(shí)，miR-101-3p抑制物組加入miR-101-3p抑制物和Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，miR-101-3p mimics組加入miR-101-3p mimics和Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，對(duì)照組僅加入等量Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑。收集各組轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞，按1.3中的方法檢測(cè)miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組細(xì)胞侵襲和遷移能力檢測(cè) ①細(xì)胞侵襲能力：采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。收集各組轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。將Transwell小室的上下室之間用包被了人工基底膠的聚碳酸酯微孔膜(孔徑8 μm)分隔，上室加入細(xì)胞懸液100 μL，下室加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基500 μL。然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8 h。取出聚碳酸酯微孔膜，用棉簽輕輕擦去基底膠和上表面的細(xì)胞，然后中性甲醛固定，蘇木素染色。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)50倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。以穿膜細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。②細(xì)胞遷移能力：采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。方法同上，但聚碳酸酯微孔膜不包被人工基底膠。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 miR-101-3p靶向調(diào)控基因檢測(cè) 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。取miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量最低的乳腺癌細(xì)胞，接種于24孔板，每孔2×104個(gè)。隨機(jī)將細(xì)胞分為野生型Rac1+miR-101-3p mimics組、突變型Rac1+miR-101-3p mimics組、野生型Rac1+陰性對(duì)照物組、突變型Rac1+陰性對(duì)照物組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合80%左右時(shí)，按Lipofectamine2000試劑盒說(shuō)明分別加入相應(yīng)的轉(zhuǎn)染物和轉(zhuǎn)染試劑。各組轉(zhuǎn)染24 h，每孔加入1×passive Lysis Buffer 100 μL，充分混勻，室溫孵育15 min。每孔取20 μL，置于96孔發(fā)光檢測(cè)板，于ModulusTM發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435、HBL-100細(xì)胞miR-101-3p表達(dá)比較 MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435、HBL-100細(xì)胞miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量分別為2.33±0.42、2.05±0.26、1.82±0.38、3.05±0.42。MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435細(xì)胞miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量均明顯低于HBL-100細(xì)胞(P均<0.05)。以MDA-MB-435細(xì)胞miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量最低。

2.2 各組miR-101-3p表達(dá)比較 對(duì)照組、miR-101-3p抑制物組、miR-101-3p mimics組miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量分別為1.47±0.39、0.58±0.16、9.22±0.82。miR-101-3p抑制物組miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，而miR-101-3p mimics組miR-101-3p相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞侵襲能力比較 對(duì)照組、miR-101-3p抑制物組、miR-101-3p mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(105.67±7.77)、(188.00±18.08)、(68.67±9.45)個(gè)。miR-101-3p抑制物組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組，而miR-101-3p mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞遷移能力比較 對(duì)照組、miR-101-3p抑制物組、miR-101-3p mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(85.67±11.50)、(194.20±15.38)、(54.67±8.33)個(gè)。miR-101-3p抑制物組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組，而miR-101-3p mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。

2.5 miR-101-3p靶向調(diào)控基因驗(yàn)證 野生型Rac1+miR-101-3p mimics組熒光素酶活性為0.21±0.04，野生型Rac1+陰性對(duì)照物組為0.64±0.09，突變型Rac1+miR-101-3p mimics組為0.65±0.05，突變型Rac1+陰性對(duì)照物組為0.59±0.09。野生型Rac1+miR-101-3p mimics組熒光素酶活性明顯低于其他三組(P均<0.05)，而其他三組兩兩比較P均>0.05。

3 討論

近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展、手術(shù)方式的不斷改進(jìn)以及靶向藥物的臨床應(yīng)用，乳腺癌早期預(yù)后明顯提高[14]。但對(duì)晚期多發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌仍缺乏有效的治療手段，患者預(yù)后仍然較差[15]。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌預(yù)后不良的主要原因。但目前乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不完全清楚[2]。miRNA是一類高度保守的小分子非編碼單鏈RNA。近年研究已證實(shí)，miRNA在多種腫瘤組織中差異表達(dá)，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡以及血管形成，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，有可能作為腫瘤的治療靶點(diǎn)。因此，深入了解miRNA的功能對(duì)于分子靶向藥物的研發(fā)具有重要意義[16，17]。miR-101-3p屬于腫瘤抑制因子，在鼻咽癌、肝癌等組織中表達(dá)明顯降低，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[18，19]。在乳腺癌組織中miR-101-3p表達(dá)亦明顯降低[20]。但其在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不清楚。

本研究首先采用qRT-PCR法檢測(cè)了乳腺癌MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-435細(xì)胞及正常乳腺HBL-100細(xì)胞中miR-101-3p表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種乳腺癌細(xì)胞miR-101-3p表達(dá)均明顯降低，且以MDA-MB-435細(xì)胞表達(dá)最低，與Liu等[20]報(bào)道一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-101-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，我們采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-101-3p抑制物、miR-101-3p mimics轉(zhuǎn)染入MDA-MB-435細(xì)胞，通過(guò)Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)觀察了細(xì)胞侵襲和遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-101-3p抑制物組細(xì)胞侵襲和遷移能力均明顯高于對(duì)照組，而miR-101-3p mimics組細(xì)胞侵襲和遷移能力均明顯低于對(duì)照組，表明miR-101-3p與乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移有關(guān)。

眾所周知，miRNA主要是通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA的3′UTR區(qū)，參與其靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]，主要體現(xiàn)在一方面可與沉默核糖蛋白復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)序列完全互補(bǔ)的方式降解目的蛋白，另一方面可通過(guò)非完全互補(bǔ)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。TargetScan軟件能夠預(yù)測(cè)miRNA的靶基因及其結(jié)合位點(diǎn)。我們采用TargetScan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rac1可能是miR-101-3p的靶基因。Rac1是一種Rho GTP酶，具有GTP和GDP兩種狀態(tài)，可結(jié)合并水解鳥(niǎo)苷酸，廣泛表達(dá)于人體各種組織。Rac1異常表達(dá)可引起糖尿病、亨廷頓舞蹈病等[21，22]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織中Rac1高表達(dá)，且其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[12，13]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在乳腺癌組織中Rac1表達(dá)亦明顯升高，并通過(guò)調(diào)控Rac1/ROS/MMPs信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[23]。為了探究miR-101-3p與Rac1的靶向調(diào)控關(guān)系，本研究雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，Rac1為miR-101-3p的直接靶基因。

綜上所述，miR-101-3p可能通過(guò)靶向調(diào)控Rac1參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。這為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的靶向治療提供了新思路。