蔡奧捷 孔祥東

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心（鄭州450052）

神經(jīng)肌肉單基因病是臨床上常見的嚴(yán)重疾病之一，病情嚴(yán)重且缺乏有效的治療手段。目前，在人類已有超過884 種神經(jīng)肌肉病被證實，涉及到492 個不同的基因（www.musclegenetable.fr），且仍在不斷增加中?；蚓庉嫾夹g(shù)，特別是CRISPR/Cas9（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9）的出現(xiàn)［1］能夠直接在基因水平上糾正突變基因，為徹底治療神經(jīng)肌肉遺傳病提供了可能。但是，目前該技術(shù)依舊面臨著許多的挑戰(zhàn)和問題。本綜述介紹了以CRISPR/Cas9 為主的基因編輯技術(shù)在神經(jīng)肌肉單基因病治療的潛在應(yīng)用進展（本綜述所涉及到的文獻沒有超出倫理規(guī)范）。

經(jīng)典的CRISPR/Cas9 編輯技術(shù)原理是Cas9 在sgRNA的引導(dǎo)下，結(jié)合PAM（protospacer-adjacent motif）序列旁邊的靶基因位點并產(chǎn)生一個雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSBs），細(xì)胞基因組可以通過非同源末端連接（nonhomologous end-joining，NHEJ）或同源重組（homology directed repair，HDR）的方式來修復(fù)DSBs［2］。其中，NHEJ 導(dǎo)致不精確的插入/缺失突變，HDR 通過同源重組將外源核苷酸序列引入基因組來產(chǎn)生精確修飾。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)，能夠通過介導(dǎo)基因敲除、基因敲入、相關(guān)基因表達激活或抑制等來糾正疾病缺陷基因，達到治療疾病的目的。該方法用于單基因病的突變修復(fù)已在多種組織細(xì)胞和模式動物中得到驗證，顯示出良好的效果。

1 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因敲除

以CRISPR/Cas9 為主的基因編輯技術(shù)通過切除突變基因或其上下游部分基因，來糾正或改善疾病的病理特征和臨床表現(xiàn)，被廣泛應(yīng)用于包括杜氏肌營養(yǎng)不良（duchenne muscular dystrophy，DMD）、脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）及強直性肌營養(yǎng)不良癥（myotonic dystrophy，DM）1 型等神經(jīng)肌肉遺傳病的基因治療。主要適用范圍為編碼基因閱讀框架的缺失以及核苷酸重復(fù)等。

1.1 閱讀框架缺失 DMD 是由DMD基因（OMIM300377）突變導(dǎo)致的X 連鎖隱性遺傳病，其發(fā)病率約為1/5 000 活產(chǎn)男嬰。DMD基因編碼抗肌萎縮（dystrophin，Dys）蛋白，其為細(xì)胞骨架蛋白，能夠維持肌肉細(xì)胞的完整性，如缺失會導(dǎo)致出現(xiàn)肌萎縮、肌無力和肌壞死等不良肌肉表現(xiàn)。該病的主要突變方式為外顯子的重復(fù)或丟失從而造成的編碼基因閱讀框架異常。對于DMD基因突變患者，可以通過跳躍突變所在的外顯子或其相鄰部位的外顯子來創(chuàng)建DMD基因組內(nèi)部的缺失來恢復(fù)閱讀框架，從而改善DMD患者抗肌萎縮蛋白功能。該方法最早是由OUSTEROUT等［3］利用ZFN 在DMD 患者成肌細(xì)胞中去除DMD基因第51外顯子來實現(xiàn)。MAGGIO 等［4］通過設(shè)計一體化的腺病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9 對DMD基因第45-52 外顯子缺失（DMD.Δ45-52）和第48-50 外顯子缺失（DMD.Δ48-50）患者來源的成肌細(xì)胞DMD基因第51 外顯子進行跳躍，成功修飾并表達Dys 蛋白。此外，LI 等［5］也通過跳躍DMD基因第45 號外顯子來恢復(fù)DMD.Δ44 患者的部分Dys 蛋白功能。

1.2 核苷酸重復(fù) DM1 是一種常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率大約為1/8 000，主要表現(xiàn)為肌萎縮、肌無力和肌強直。該病主要致病原因為編碼強直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶（myotonic dystrophy protein kinase，DMPK）基因（OMIM 605377）非編碼區(qū)域3′端（CTG）n 的重復(fù)序列異常擴增。當(dāng)該三聯(lián)核苷酸重復(fù)次數(shù)從正常的5～37 增加到超過50時，就會造成RNA 結(jié)合蛋白的隔離以及DMPK 基因的廣泛異常剪接和（或）沉默，產(chǎn)生DM1 的臨床表現(xiàn)［6］。有研究［7］利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，成功敲除DMPK 基因3′端（CTG）n 重復(fù)序列來修復(fù)DM1 患者來源iPSC 誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞，并通過Southern 印跡和單分子實時（single-molecule real-time，SMRT）測序證實了CTG 重復(fù)擴增序列的高效切除。該方法介導(dǎo)的核苷酸重復(fù)序列切除也適用于Friedreich型共濟失調(diào)或脊髓小腦共濟失調(diào)8型等。

2 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因敲入

在CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的外顯子跳躍治療方法中，主要原理是通過NHEJ 引起的模糊缺失/修復(fù)來阻止外顯子剪接進而恢復(fù)蛋白表達。然而，此方法不適用于突變位于外顯子內(nèi)編碼蛋白質(zhì)基本域的情況，這時就需要HDR 介導(dǎo)的精確修復(fù)。有研究［8］通過HDR 成功修復(fù)mdx 小鼠模型dmd 基因的第23 外顯子的無義突變。但HDR 介導(dǎo)的修復(fù)效率通常低于NHEJ，并且HDR 需要在細(xì)胞周期的S 期和G2 期才能發(fā)揮作用，因為此時的姐妹染色單體才可以作為修復(fù)模版補充目的基因。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，一系列提高HDR 介導(dǎo)的修復(fù)效率的方法被發(fā)現(xiàn)，如通過降低NHEJ 活性來減少與HDR 競爭的方法［9］，此類方法在DMD 完全修復(fù)治療的研究中可能得到應(yīng)用。

該策略同樣適用于SMA 的基因治療。SMA 是常染色體隱性遺傳的神經(jīng)肌肉病，在新生兒的發(fā)病率大約為1/6 000～1/10 000，人群攜帶者頻率為1/40～1/50。運動神經(jīng)元生存基因（survival motor neuron，SMN1）（OMIM600354）基因的突變是造成該病發(fā)生的主要原因，但其臨床表現(xiàn)受到SMN1的同源基因SMN2（OMIM601627）的調(diào)節(jié)。SMN2與SMN1的主要不同在于第7 外顯子中c.840 位點的C＞T的堿基差異。該異常能導(dǎo)致編碼的蛋白缺少第7 外顯子編碼的核心區(qū)域，產(chǎn)生不穩(wěn)定的“截短蛋白”（SMNΔ7）和低產(chǎn)率的全長蛋白質(zhì)（僅約10%～15%）。在SMN1中有缺失/突變的SMA 患者中，SMN2能起劑量補償作用，其拷貝數(shù)會影響疾病的嚴(yán)重程度（SMN2的拷貝數(shù)越多，患者表現(xiàn)癥狀越輕）。有研究［10］利用CRISPR-cpf1 和單鏈寡核苷酸介導(dǎo)HDR 將來自SMA 患者尿液細(xì)胞誘導(dǎo)的iPSC 中SMN2基因修飾為SMN1樣基因，成功改善了神經(jīng)元，可能為SMA 的治療提供一種光明的前景。

3 相關(guān)基因表達激活或抑制

對于一些疾病來說，通過激活目的蛋白功能相近或者抑制目的蛋白功能相反的蛋白基因的表達也可以改善疾病的臨床表現(xiàn)。Utrophin（UTRN）作為Dys 蛋白結(jié)構(gòu)相似的旁系同源物，上調(diào)其轉(zhuǎn)錄水平能夠代償性的補償Dys蛋白缺失的影響。WOJTAL 等［11］利用dCas9-VP160 的雙sgRNA 靶向兩個UTRN 啟動子來上調(diào)utrophin 的表達量，結(jié)果顯示能夠?qū)MD 患者成肌細(xì)胞中的utrophin 蛋白表達提高1.7～6.9倍。在表達抑制上，有研究［12］針對肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）這種能導(dǎo)致肌肉萎縮的蛋白，利用AAV8介導(dǎo)的SaCas9 在組織特異性雙肌肉肌酸激酶（dMCK）啟動子的幫助下體內(nèi)靶向肌肉組織，抑制MSTN 表達，在野生型小鼠中能夠減弱肌肉損失。此外，有研究［13］證明dCas9與轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白Kruppel-associated box 結(jié)構(gòu)域（KRAB）的融合能夠通過招募異染色質(zhì)來有效抑制內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，能夠沉默大約80%的基因，可以被作為DMD 等基因治療研究的一個突破口。

4 堿基替換

對于一些點突變患者，單堿基編輯的策略顯得更為實用。有研究［14］將APOBEC1 連接在dCas9 的N 端，能夠誘導(dǎo)C→T 突變，并顯示出比HDR 更高的效率。此外，GAUDELLI 等［15］通過將腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editors，ABEs）與催化功能受損的CRISPR/Cas9 結(jié)合，成功誘導(dǎo)堿基替換而不會發(fā)生DNA 雙鏈切割。該技術(shù)不僅能全面的對點突變進行直接修復(fù)，而且能夠通過破壞提前終止密碼子或剪接受體來誘導(dǎo)外顯子跳躍。

5 基因編輯技術(shù)臨床應(yīng)用面臨的問題

然而，CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因治療依然面臨著許多重要的問題，其中最重要的是脫靶效應(yīng)以及安全性問題。

5.1 脫靶效應(yīng) 脫靶效應(yīng)是CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因治療研究中不可忽視的重要問題。脫靶可能通過引起未知位置的不確定的插入和缺失來導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，提高潛在的疾病罹患風(fēng)險。目前人們可以通過全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）來監(jiān)測是否存在脫靶效應(yīng)，但該方法需要較高的測序深度和靈敏度，花費較高。目前有許多種方法被發(fā)現(xiàn)用來能夠提高CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的特異性或者減少其脫靶效應(yīng)，如截短的sgRNA、fCas9 系統(tǒng)策略（FokⅠ-dCas9）［16］、Cas9-sgRNA 的劑量滴定［17］以及增 強 版［18］或 高 保 真［19］的Cas9 等。新 發(fā) 現(xiàn) 的CRISPRCas13a 似乎具有更強的特異性，研究人員利用RNA 測序證實在人類細(xì)胞系中，Cas13a 只會靶向由導(dǎo)向RNA 指定的RNA，而讓細(xì)胞內(nèi)其他的RNA 序列保持完整［20］。

5.2 安全性問題 CRISPR/Cas9 是一種源自于微生物的基因編輯系統(tǒng)，目前使用最廣泛的Cas9 蛋白是來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的SaCas9 和來自化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的SpCas9。在CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因治療過程中，當(dāng)AAV 或者其他載體攜帶Cas9 蛋白進入人體后，這些載體介導(dǎo)Cas9 蛋白的持續(xù)表達，若患者體內(nèi)預(yù)先存在針對Cas9 抗原的特異性記憶T 細(xì)胞，則記憶T 細(xì)胞會迅速活化為細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）對胞內(nèi)有Cas9 蛋白表達的細(xì)胞進行直接殺傷，從而導(dǎo)致基因治療失敗，甚至有可能引發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致器官功能障礙。研究［21］發(fā)現(xiàn)，在70%的健康人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Cas9 蛋白同源物抗體，近半數(shù)人具有Cas9 蛋白同源物的抗原特異性T 細(xì)胞，而且這些特異性T 細(xì)胞是原本就存在，而非在檢測過程中由于首次暴露于抗原產(chǎn)生的。這意味著，在大部分人體內(nèi)原本就存在針對Cas9 蛋白的體液免疫和細(xì)胞免疫，也提示在人體中已經(jīng)存在的適應(yīng)性免疫反應(yīng)可能難以保證CRISPR/Cas9 的安全性和有效性，其治療的安全性應(yīng)該慎重評估。

此外，病毒載體本身可能導(dǎo)致的免疫和毒性反應(yīng)也是CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因治療安全性評估的重要方面。由于人體內(nèi)沒有預(yù)先存在針對AAV 的抗體，且該病毒不整合入基因組，因此AAV 是目前CRISPR/Cas9 基因治療研究最有前景的載體。2018年一個研究［22］發(fā)現(xiàn)在恒河猴和仔豬身上高劑量使用載體AAV9 進行SMA 基因治療時，會產(chǎn)生嚴(yán)重的肝臟和神經(jīng)元毒性。研究結(jié)果表明，肝臟和感覺神經(jīng)元毒性可能是高劑量靜脈內(nèi)遞送AAV 載體的普遍性質(zhì)，與衣殼血清型或轉(zhuǎn)入基因無關(guān)。因此，探究AVV 載體免疫毒性發(fā)生的原因和機制，提出解決策略并評價病毒劑量的安全范圍，對今后的臨床研究意義重大。

6 小結(jié)

雖然以CRISPR/Cas9 為主的基因編輯策略依然面臨著許多亟待解決的問題，但不可否認(rèn)的是其飛速發(fā)展為神經(jīng)肌肉單基因遺傳病在內(nèi)的許多遺傳病的徹底治愈帶來了光明的前景。受益于基因編輯技術(shù)的發(fā)展，目前關(guān)于人體體細(xì)胞的基因編輯實驗已經(jīng)得到測試。近日，Editas Medicine 公司開展的使用CRISPR 基因編輯手段治療Leber 先天性黑朦10 型患者（LCA10）臨床實驗已經(jīng)獲得FDA 的批準(zhǔn)，該方法通過眼部局部注射并利用感光細(xì)胞特異性啟動子GRK1，大大降低了安全性問題，是CRISPR 基因治療領(lǐng)域的重要里程碑。然而，目前尚無有效的手段能夠徹底解決包括脫靶效應(yīng)和免疫問題帶來的影響，對于胚胎或配子的可遺傳基因組編輯帶來的風(fēng)險仍然難以評估。種系編輯不僅會對個體產(chǎn)生意想不到的有害影響，也會對個體的后代產(chǎn)生難以評估的風(fēng)險?；蛑委煹陌l(fā)展應(yīng)遵循嚴(yán)格的技術(shù)監(jiān)管、合理的倫理支撐以及廣泛的社會監(jiān)督，應(yīng)該加強國際間的交流合作，盡快制定關(guān)于基因編輯技術(shù)的國際化技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和適合各國實際國情的倫理規(guī)范。