黃海濤，胡 江，徐冬梅，譚華強，李煥秀*

(1．四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，四川 成都 611130; 2．綿陽市農(nóng)業(yè)科學研究院，四川 綿陽 621023)

豇豆是中國重要的蔬菜類型之一，南北各地均可栽培，原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是耐熱性蔬菜，能耐高溫，不耐霜凍，15 ℃以下的溫度發(fā)芽較差。在長江流域，3-7月份都可以播種，5月下旬至10月份收獲，春豇豆提早栽培直播后，遇低溫陰雨發(fā)芽慢，種子容易發(fā)霉腐爛，出苗后遇霜凍容易造成死苗的情況。培育耐低溫蔬菜新品種是解決蔬菜低溫冷害的有效途徑之一。國內(nèi)外在番茄、黃瓜、茄子、辣椒和西瓜耐低溫育種方面已開展了大量的工作[1-8]，在甜瓜、黃瓜、苦瓜和水稻等作物上已建立耐冷性綜合評價體系[9-14]。近年來，中國學者開展了少量的豇豆耐冷性評價研究[15-17]，但主要停留在單一指標的評價，對豇豆萌芽期的耐冷性綜合評價研究尚未見報道。本研究對50個豇豆萌芽階段進行14 ℃低溫處理，采用主成分分析、隸屬函數(shù)分析、聚類分析和回歸分析法對能夠發(fā)芽的43個豇豆品種萌芽期耐冷性進行綜合性評價，篩選豇豆萌芽期耐冷性評價體系，以期為豇豆耐冷性種質(zhì)資源的篩選提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗處理

參試品種50個，種子來自綿陽市農(nóng)業(yè)科學研究院從國內(nèi)外育種科研單位收集而來并經(jīng)單株留種提純的種質(zhì)資源。每個品種取30粒種子，重復3次，置于鋪有2層濕濾紙的培養(yǎng)皿中，澆上水，25 ℃下浸種4 h。將多余的水倒掉，放入光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽，一組為處理組，溫度設置為14 ℃，一組為對照組，25 ℃正常溫度發(fā)芽。種質(zhì)資源的名稱和來源見表1。

1.2 相關(guān)指標測定與計算

播種前統(tǒng)計每個品種的千粒質(zhì)量，播種后，每隔12 h記錄一次萌發(fā)數(shù)，開始萌發(fā)后連續(xù)3 d無新增萌發(fā)或萌發(fā)率為100%時記為萌發(fā)結(jié)束，常溫(25 ℃)下第5天和低溫(14 ℃)下第12天分別統(tǒng)計發(fā)芽率、胚根長、胚根質(zhì)量和總鮮質(zhì)量，計算相對發(fā)芽率(RGR)、相對發(fā)芽指數(shù)(RGI)、相對活力指數(shù)(RVI)、相對胚根長(RRL)和相對胚根鮮質(zhì)量(RRM)、相對總鮮質(zhì)量(RTM)。

表1 參試材料Table 1 Experiments materials

千粒質(zhì)量：選取1 000粒飽滿種子，稱量，測3次重復值，求其平均值。

相對發(fā)芽率(RGR)=低溫發(fā)芽率/正常溫度發(fā)芽率×100%；相對發(fā)芽指數(shù)(RGI)=低溫下發(fā)芽指數(shù)/常溫下發(fā)芽指數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt(Gt為在時間t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽日期)。

相對發(fā)芽活力指數(shù)(RVI)=低溫下發(fā)芽活力指數(shù)/常溫下發(fā)芽活力指數(shù)×100%

發(fā)芽活力指數(shù)=發(fā)芽率×RL(RL=胚根長)。

相對胚根長(RRL)=低溫下胚根長/常溫下胚根長×100%；相對胚根鮮質(zhì)量(RRM)=低溫下胚根鮮質(zhì)量/常溫下胚根鮮質(zhì)量×100%；相對總鮮質(zhì)量(RTM)=低溫下總鮮質(zhì)量/常溫下總鮮質(zhì)量×100%。

1.3 相關(guān)指標的計算

相關(guān)指標計算及數(shù)據(jù)分析方法參照苗永美等[11]的方法。

隸屬函數(shù)分析：每一品種綜合指標得分的隸屬函數(shù)值用以下公式計算：

μ(xij)=(xij-xjmin)-(xjmax-xjmin)

式中，xij表示i材料在主成分分析中第j個綜合指標，xjmin表示i材料在主成分分析中第j個綜合指標的最小值，xjmax表示i材料在主成分分析中第j個綜合指標的最大值。求出所有品種的綜合指標的隸屬函數(shù)值。對于同一綜合指標而言，根據(jù)各品種隸屬函數(shù)值的大小，可以對其耐冷性進行分級。本試驗i=1,2,3，…，43；j=1, 2。

權(quán)重的確定:根據(jù)各個主要綜合指標貢獻率的大小，用以下公式求出各綜合指標的權(quán)重。

式中，wj值表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的相對重要程度即權(quán)重，pj為主成分分析中第j個綜合指標的貢獻率，n表示主成分的個數(shù)，本試驗n=2。

綜合評價值計算:根據(jù)隸屬函數(shù)值和權(quán)重的計算結(jié)果，用以下公式計算各品種的綜合耐冷性能的強弱。

式中，Di值為第i材料耐冷性的綜合評價值，n表示主成分的個數(shù)，本試驗n=2。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 IBMSPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析和回歸分析，獲得各指標的貢獻率，逐步回歸法建立D值與指標之間的回歸方程。利用回歸方程計算耐冷性綜合評價預測值(VP)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豇豆萌芽期耐冷性相關(guān)性狀

調(diào)查14 ℃和25 ℃條件下豇豆萌芽期相關(guān)性狀，計算低溫與常溫數(shù)據(jù)的比值，結(jié)果見表2。

表2 不同豇豆品種萌芽期耐冷性相關(guān)性狀指標Table 2 Character indices related to chilling resistance of different cowpea varieties at germination stage

(續(xù)表2Continuedtable2)

編號Number千粒質(zhì)量/gKilo-beans mass GR(25 ℃)/%RGR/%RGI/%RVI/%RRL/%RRM/%RTM/%25165.00±5.0198.89±1.9298.85±1.9946.07±2.1751.19±6.1961.19±8.5657.22±2.1992.79±5.6526210.50±2.17100.00±0.00100.00±0.0044.46±4.4457.44±6.0577.44±9.9972.89±5.5492.38±4.5827136.80±5.2497.78±1.9286.39±3.1630.84±5.8855.64±4.4477.23±6.2270.78±4.4682.92±0.4228142.90±2.40100.00±0.00100.00±0.0047.73±8.7155.55±2.8385.55±6.0682.11±4.9394.21±4.8329174.00±4.45100.00±0.00100.00±0.0045.93±2.6547.95±2.6457.95±2.0941.89±6.3165.13±5.5130150.20±5.37100.00±0.0090.00±3.3342.36±3.2354.37±2.3171.52±6.1157.89±4.8773.58±4.6431151.50±2.95100.00±0.0071.11±8.3924.48±3.1458.96±5.3687.31±1.2280.56±5.4689.75±5.6732151.60±5.5598.89±1.9246.09±2.5214.47±3.8710.07±1.7834.40±3.6737.33±4.2061.92±6.5033185.50±3.92100.00±0.0051.11±5.0917.89±1.8136.97±1.3774.90±5.2070.78±4.0286.67±1.4134177.60±2.3197.78±3.8526.35±8.288.81±2.1123.14±4.8756.78±2.5349.00±5.7464.46±4.5035177.00±6.2697.78±3.8556.67±5.7719.11±4.0128.05±1.5084.05±2.4058.67±6.6771.25±3.443680.50±1.87100.00±0.0095.56±1.9341.95±5.2540.00±0.4470.00±3.2682.00±1.1787.00±4.7537165.50±1.81100.00±0.0080.00±3.3344.68±5.4436.94±4.4592.80±2.1385.67±9.1992.38±4.2638171.00±0.9298.89±1.9270.77±2.2826.38±1.1814.29±4.0220.41±0.7633.56±2.1559.42±4.5639146.70±3.2098.89±1.9270.90±10.3925.38±5.5123.77±7.2733.95±2.6646.11±5.2470.67±6.4640180.60±5.58100.00±0.0090.00±3.3342.00±1.0740.73±2.3255.25±2.9151.44±4.2190.42±3.6941155.30±3.3997.78±3.8560.16±5.6441.11±6.4755.43±4.4075.43±8.5966.44±10.4373.63±4.8742174.00±4.57100.00±0.0051.11±5.0932.60±3.0252.45±2.8390.57±2.6379.78±7.5186.17±2.2943161.50±8.48100.00±0.0075.55±6.9425.23±6.0852.53±2.8866.53±5.5851.67±5.5564.67±1.9544167.50±2.6998.89±1.920.00±0.00-----45119.40±1.08100.00±0.000.00±0.00-----46157.30±4.0698.89±1.920.00±0.00-----47127.80±6.92100.00±0.000.00±0.00-----48156.50±1.73100.00±0.000.00±0.00-----49170.00±3.0498.89±1.920.00±0.00-----50135.70±2.6997.78±3.850.00±0.00-----F值 F values182.180.7396.4320.7644.1969.6425.6816.25F0.053.193.193.193.223.223.223.223.22變化幅度Range80.5～210.597.78～100.00.00～100.008.81～48.817.24～59.8518.10～94.2831.44～85.6742.71～94.21

注：7個品種于14 ℃低溫處理下完全未發(fā)芽，未統(tǒng)計耐冷性相關(guān)性狀，結(jié)果分析為43個發(fā)芽的品種。

Note: 7 cultivars did not germinate under low temperature treatment of 14 ℃,so there isno statistics on the traits related to cold tolerance. The analyses below are based on the 43 varieties that could germinate.

由表2可以看出，各品種千粒質(zhì)量變幅為80.5～210.5 g，品種間差異顯著(F>F0.05)，25 ℃常溫處理，所有品種的發(fā)芽率都超過了97%，品種間差異不顯著(FF0.05)。多數(shù)品種發(fā)芽率有降低的趨勢，4個品種的相對發(fā)芽率達到100%，7個品種完全未發(fā)芽，不同品種相對發(fā)芽率變幅為0.00%～100.00%；參試43個品種相對萌發(fā)指數(shù)變幅為8.81%～48.81%，相對發(fā)芽活力指數(shù)變幅為7.24%～59.85%，相對胚根長的變幅為18.10%～94.28%，相對胚根鮮質(zhì)量的變幅為31.44%～85.67%，說明低溫影響種子的萌發(fā)和萌發(fā)后胚根的生長。

2.2 豇豆萌芽期耐冷性性狀的相關(guān)分析

對43個14 ℃發(fā)芽的品種低溫脅迫下不同萌芽指標相對值以及千粒質(zhì)量進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)矩陣見表3。結(jié)果表明品種的低溫脅迫與常溫處理發(fā)芽指標的相對值和千粒質(zhì)量間相關(guān)性不顯著，6個發(fā)芽指標僅僅相對發(fā)芽率(RGR)與相對胚根長(RRL)相關(guān)性不顯著，其他各指標間均呈顯著性正相關(guān)。說明豇豆萌芽期耐冷性相關(guān)性狀各指標信息之間存在重疊，直接利用各萌芽期單項指標不能直觀、大量評價豇豆的耐冷性，需要在此基礎(chǔ)上進一步綜合分析。

表3 豇豆不同萌芽指標之間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis among germination indices of cowpea

注： *和**分別表示在0.05 和0.01 水平上差異顯著。

Note:* and ** indicated significant difference atP<0.05 andP<0.01，respectively.

2.3 豇豆萌芽期不同指標主成分分析

用SPSS軟件將表2數(shù)據(jù)相關(guān)性顯著的萌芽指標RGR、RGI、RVI、RRL、RRM、RTM標準化后進行主成分分析，進一步抽取各主成分的特征向量和累計貢獻率，得到樣本相關(guān)矩陣的特征向量和累計貢獻率見表4。結(jié)果表明，前2個主成分的貢獻率分別為63.819%、17.411%，累計貢獻率達到81.230%的信息，理論上，>80%的累積貢獻率即認為具有較強的信息代表性，將原來的6個單項指標轉(zhuǎn)換為2個相互獨立的綜合指標。

表4 各主成分的特征向量及貢獻率Table 4 Eigenvectors of principal components(PC) and contribution rate

由表4可見，第1主成分(PC1)6個指標大小基本一致，不同指標對第1主成分都做出了大小相當?shù)呢暙I。第2主成分(PC2)包含相對發(fā)芽率(RGR)、相對發(fā)芽指數(shù)(RGI)、相對根長(RRL)、相對胚根鮮質(zhì)量(RRM)等信息，可作為低溫發(fā)芽和根系生長情況指標。計算出2個主成分的權(quán)重分別為0.785 7和0.214 3。

2.4 豇豆萌芽期耐冷性綜合評價

根據(jù)2個主成分的特征向量及各指標的相對值求出43份材料的2個主成分綜合指標(CI)和隸屬函數(shù)值(μ)， 根據(jù)權(quán)重和隸屬函數(shù)值，進一步計算出綜合評價值，以D值大小對43份豇豆品種的耐冷性進行排序，結(jié)果見表5。

從表6可以看出，參試品種耐冷性綜合評價指標D值變化范圍為0.113 1～0.905 1。根據(jù)D值對43個品種的耐冷性進行排序為：28、26、25、36、37、20、9、1、30、40、29、22、27、5、23、3、18、31、16、41、42、2、43、21、10、17、19、33、24、8、4、39、35、13、38、6、14、11、32、7、15、34、12。

采用最遠鄰位素Euclidean 距離法對各品種D值聚類分析。聚類分析結(jié)果見圖1。將參試的43個豇豆的耐冷性可以分為4類，分為Ⅰ類(耐冷型)、Ⅱ類(中度耐冷型)、Ⅲ類(耐冷較差型)、Ⅳ類(冷敏感型)。Ⅰ類(耐冷型)包括7個品種，分別為26、28、20、37、9、36、25；Ⅱ類(中度耐冷型)包括15個品種，分別為3、18、23、5、1、30、22、27、29、40、2、42、16、41、31；Ⅲ類(耐冷較差型)包括12個品種，分別為17、19、10、21、43、13、35、4、39、8、24、33；Ⅳ類(冷敏感型)包括9個品種，分別為7、32、15、34、12、6、14、38、11。

注：CI(1)、CI(2)：分別根據(jù)PC1、PC2特征向量計算的綜合指標。μ(1)、 μ(2)分別為CI(1)、CI(2)的隸屬函數(shù)值。D為綜合評價值；VP為預測值。

Note:Comprehensive indicators calculated from PC1 and PC2. μ (1) and μ (2) is the membership functions ofCI(1) andCI(2).Dvalue is the comprehensive evaluation value;VPis the predicted value.

2.5 豇豆萌芽期耐冷性逐步回歸分析

為更精確分析豇豆的耐冷性與萌芽期各指標相對值的關(guān)系，建立豇豆萌芽期耐冷性評價的數(shù)學模型。以D值為因變量，萌芽期各調(diào)查指標的相對值為自變量，利用SPSS軟件進行逐步回歸分析，建立最優(yōu)回歸方程：D=-0.357+1.032X2+0.404X3+0.555X6[式中，X2代表相對發(fā)芽指數(shù)(RGI)，X3代表相對發(fā)芽活力指數(shù)(RVI)，X6代表相對總鮮質(zhì)量(RTM)]，方程決定系數(shù)(R2)=0.969，P<0.01。由方程可知，5個單項指標中3個指標對豇豆耐冷性都有顯著的影響，可以作為豇豆耐冷性的鑒定指標。將萌芽期3個單項指標(RGI、RVI、RTM)相關(guān)數(shù)據(jù)代入回歸方程得到預測值(VP)(表5)，對預測值(VP)與綜合評價值(D)進行相關(guān)性分析，得出它們之間的相關(guān)系數(shù)(r)=0.984 52，呈極顯著的正相關(guān)，說明該回歸方程對豇豆萌芽期耐冷性評價更直觀、簡單有效，可用于豇豆的萌芽期耐冷性綜合評價。

圖1 豇豆萌芽期耐冷性綜合評價指標D值聚類Fig.1 Chilling resistance comprehensive evaluation index ofD value cluster for cowpea germination

3 討論與結(jié)論

植物的耐冷性為復雜的數(shù)量性狀，受多基因控制[17-19]。不同蔬菜品種在低溫下萌發(fā)能力有顯著差異，基因型很大程度上決定種子發(fā)芽過程的耐冷性。研究豇豆的冷害、耐冷機制和篩選萌芽期耐冷的種質(zhì)資源材料時，萌芽期低溫的發(fā)芽能力、根系活力指標、芽的生長能力及生理生化指標是豇豆耐冷性篩選的重要指標。一些學者在甜瓜、黃瓜、辣椒萌芽期耐冷性評價方法上開展了研究[9，11，20]。在豇豆的萌芽期耐冷性鑒定中目前還沒有系統(tǒng)的鑒定和評價體系，在以前豇豆的耐冷性研究中，僅僅使用某些指標的絕對值來比較耐冷性，由于種子成熟度、種子生產(chǎn)期、處理過程、種子生產(chǎn)環(huán)境和儲藏條件都影響種子對低溫的反應，采用單一指標不能消除不同品種本身種子差異的影響，影響結(jié)果的準確性[9-10]，本試驗所用豇豆種子均為筆者課題組同一年份采種獲得，試材均為飽滿、成熟度好的種子，各個品種在常溫下的種子發(fā)芽率均達到97%以上，同時本研究采取低溫與常溫處理下各指標的相對值進行比較分析，有效消除了種子本身差異造成的誤差。本研究發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計的6個萌芽期相對性狀指標都與千粒質(zhì)量相關(guān)性不顯著，這與前人在其他作物上的研究結(jié)果并不一致[21]，可能與本試驗選取研究指標為低溫脅迫與常溫處理下豇豆品種性狀的相對值有關(guān)。

本試驗對豇豆種子千粒質(zhì)量及萌芽期低溫脅迫下相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對發(fā)芽活力指數(shù)、相對胚根長、相對胚根鮮質(zhì)量、相對總鮮質(zhì)量6個耐冷性指標進行相關(guān)性分析，并對這萌芽期6個耐冷指標進行綜合分析判斷，6個指標除相對發(fā)芽率與相對胚根長相關(guān)性不顯著外，其他各指標間均呈顯著性正相關(guān)，說明6個指標提供的信息有重疊，利用單一指標評價萌芽期耐冷性不可靠。根據(jù)主成分的特征向量和各指標的相對值進一步將原來的6個指標轉(zhuǎn)換為獨立的2個綜合指標，并在此基礎(chǔ)上計算出隸屬函數(shù)值、權(quán)重、綜合評價值，并對綜合評價值進行排序，既利用各指標間內(nèi)在的深層次的聯(lián)系，又克服因各項指標的相關(guān)性帶來的信息重疊導致的誤判。利用聚類分析法對D值進行分類，將參試的43個豇豆的耐冷性分為Ⅰ類(耐冷型)、Ⅱ類(中度耐冷型)、Ⅲ類(耐冷較差型)和Ⅳ類(冷敏感型)4類。以D值為因變量，萌芽期各調(diào)查指標的相對變化量為自變量建立最優(yōu)回歸方程：D=-0.357+1.032X2+0.404X3+0.555X6，用該方程得到的豇豆耐冷性預測值(VP)與耐冷性綜合評價值D值相關(guān)性達到顯著水平，說明用此方程對豇豆萌芽期耐冷性進行預測準確性較高，可用于下一步開展大量豇豆資源的耐冷性評價和鑒定。

本研究首次在豇豆萌芽期階段將耐冷性這一主觀的、經(jīng)驗的模糊判斷分析進行數(shù)理統(tǒng)計的定量表達，并對43個品種進行萌芽期耐冷性綜合評價，篩選到7個萌芽期耐冷性較好的豇豆品種以及9個極度敏感的豇豆品種。篩選到耐冷種質(zhì)資源將為下一步開展有性雜交選育耐寒的、適宜春季提早栽培的豇豆品種以及開展豇豆遺傳圖譜構(gòu)建和耐冷性狀的QTL定位提供重要的親本來源。