段 慧，李弈仙，魏永勝，康靖全

(西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100)

植物根系的活力是植株吸收、合成和生長的綜合表現(xiàn)，影響整株植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量形成。根系不僅起到固定與支持作用，同時也為整個植株尤其是地上部分提供生長發(fā)育所必需的水、礦質(zhì)、氨基酸和激素(如脫落酸和細胞分裂素)等物質(zhì)。因此，在植物相關(guān)研究中，無論是農(nóng)林草[1-6]、園林植物[7]還是生態(tài)學領(lǐng)域[8-9]，根系活力都是常用的反映植株生活力的重要生理指標。根系活力與呼吸密切相關(guān)，因此可采用甲烯藍吸附、α-萘胺氧化和TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑，2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，C19H15N4Cl，相對分子質(zhì)量為334.81)還原法，或傷流液質(zhì)量[10-11]和同位素示蹤[12]等方法。其中TTC法因為準確、重現(xiàn)性好而被廣泛使用[13]。TTC是標準氧化還原電位為80 mV的氧化還原物質(zhì)，被還原后即生成紅色而不溶于水的三苯基甲月替 (1,3,5-triphenylformazan， TPF) 。利用比色法，在485 nm檢測乙酸乙酯中TPF含量，以單位時間根質(zhì)量還原的TTC量反映根系活力(μg 或mg·g-1·h-1)。作為一種定量評價根系活力的指標，測定過程需要建立TPF標準曲線。其原理是利用保險粉(連二亞硫酸鈉，Sodium hydrosulfite，Na2S2O4，相對分子質(zhì)量為174.10)還原TTC生成紅色的TPF，再利用乙酸乙酯萃取TPF，進而制作成含有不同量的TPF乙酸乙酯溶液建立標準曲線。其中保險粉的加入量在理論上應該是過量的[14]，不足則顯色淡，導致根系活力測定結(jié)果被高估，但保險粉加入過多，與TTC反應所剩余的部分會在乙酸乙酯中形成不溶黏性物影響最終的比色結(jié)果。那么，保險粉的適宜用量應該是多少呢？為此，筆者查閱了高等教育出版社和科學出版社等9家出版單位的23部植物生理學實驗指導(或教程)。TPF標準梯度溶液建立的方法可歸納為2種，一種是分別在裝有不同濃度的TTC溶液的6～7個試管中加入少量保險粉，每個試管約2 mg，并保持一致[15-16]；另一種是先在已知濃度的TTC溶液中加“少許”(沒有給出具體質(zhì)量)保險粉，產(chǎn)生TPF并用乙酸乙酯定容后形成TPF母液，再分別吸取不同體積的TPF母液用乙酸乙酯定容至10 mL建立TPF標準梯度溶液[17-18]。對于第1種，在實際操作過程中稱取保險粉2 mg需要使用百萬之一天平，而多數(shù)科研實驗室和普通教學實驗不具備條件，即使具備條件，操作中也很困難，2 mg的保險粉是否達到過量的要求也不明確。如果不稱量則和第2種方法一樣，無法確定具體質(zhì)量，更無法保持各試管中加入量的一致性。生理學實驗指導(或教程)是實驗教學和科學研究中相關(guān)指標測定的方法來源，指導書中的錯誤會導致錯誤的實驗或測量結(jié)果，在實驗教學中則誤導學生，在科學研究中得到錯誤的結(jié)論。因此，需要對已經(jīng)公開發(fā)表的科學文獻進行檢測，以確定是否因方法不正確產(chǎn)生了錯誤的結(jié)果，并通過試驗，確定保險粉的適宜用量，以期為根系活力相關(guān)的研究和教學提供科學的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑有保險粉(天津市標準科技有限公司)、TTC(上海遠帆助劑廠)和乙酸乙酯(浙江雙林化工廠)，均為分析純。稱量采用瑞士普利賽斯Precisa 十萬分之一電子天平(EP225SM-DR)，比色采用日立紫外分光光度計(U-3900H)，15 mL具塞刻度試管及100 mL 容量瓶。

1.2 試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)采集

試驗設(shè)計的保險粉目標用量分別為0.02、0.04、0.06、0.1、0.12、0.15和0.20 g，每個目標量稱取2份(重復)，記錄實際值(保留5位小數(shù))。分別放入14 支試管中，各加5 mg·mL-1TTC溶液(0.499 64 g TTC蒸餾水定容至100 mL， 0.5 g·mL-1) 5 mL[15]，搖動，生成TPF后各加乙酸乙酯10 mL，充分振蕩后避光靜置4 h后比色。為避免比色杯的影響，比色過程中只使用2支比色杯，一支用于純乙酸乙酯為對照，另一支用于樣品液，每次比色時用1 mL樣品液潤洗比色杯2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系活力研究的文獻計量結(jié)果

由于所查閱的實驗指導書介紹的標準曲線均難以操作，因此推測以TTC法測定根系活力的研究結(jié)果會有很大的偏差。為了驗證推測，進行文獻計量分析。在中國知網(wǎng)(CNKI)中國期刊全文數(shù)據(jù)庫農(nóng)業(yè)科技和生物學專輯中，以(摘要=根系活力)(精確匹配)為檢索條件共檢索到5 699 篇文獻，其中標題=根系活力的共319篇，采用TTC法(全文=TTC)的55篇，α-萘胺法25篇，傷流液法29篇。抽樣提取了中國農(nóng)業(yè)科學、農(nóng)業(yè)工程學報、林業(yè)科學、園藝學報、草業(yè)學報和生態(tài)學報等雜志中25篇研究文獻根系活力結(jié)果(表1)，涉及小麥、玉米、水稻等作物。數(shù)據(jù)顯示，根系活力平均值最高為350 mg·g-1·h-1[6]，而最低的僅為4.4 × 10-4mg·g-1·h-1[19]，最高平均值是最低平均值的約80萬倍。同種作物根系活力的平均值在不同文獻之間差異較大，如小麥6 699倍，苜蓿93倍，水稻11倍。這種差異是植物種和試驗處理所無法達到的。因此，不適合的分析方法會導致分析結(jié)果的嚴重失真，誤導理論研究和生產(chǎn)實踐。

2.2 TPF溶液吸收曲線

為了確保后續(xù)試驗中比色的可靠性，對TPF乙酸乙酯溶液比色的最適波長進行檢測。起始波長700 nm，終止波長380 nm，掃描速度1 200 nm·min-1。結(jié)果(圖1)顯示，在483、484、485和486 nm處有單一吸收峰，吸光值分別為1.115、1.114、1.114和1.113。因此，選擇485 nm作為檢測波長是合理的。

2.3 保險粉用量與TPF溶液吸光值的關(guān)系

本試驗是在5 mL 5 mg·mL-1TTC溶液中加入保險粉，生成TPF后再溶于10 mL乙酸乙酯，萃取后比色。理論上保險粉還原TTC過程中，與TTC的摩爾比為1∶1，因此5 mL 5 mg·mL-1TTC溶液中含有25 mg TTC與保險粉反應時，需要保險粉為13 mg。但試驗結(jié)果(圖2)顯示，保險粉的用量在150 mg 以下時，保險粉用量與吸光值呈線性相關(guān)(R2=0.996 2，n=6,P<0.000 1)，超過150 mg后，吸光值不再增加。因此，保險粉的最低量應為150 mg (約為理論值的11倍)。部分實驗指導[15]中，標準曲線制作時，先加入質(zhì)量分數(shù)為0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、和0.005%的TTC溶液5 mL，然后各加約2 mg保險粉，并且要求各試管中保險粉用量一致。這一操作是不合理的，因為TTC含量不同，所以保險粉用量可以不同。對應于5 mL 0.04% TTC溶液需要保險粉1.04 mg。原指導書中的用量是超過理論需要量，但實際操作中還達不到需要量(約11 mg)，仍然會導致結(jié)果高估。文獻分析部分可證明這一點。

表1 基于文獻計量的TTC法測定的常見作物及林、草的根系活力Table 1 The roots viability of common crop, tree and grass species tested use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) based on bibliometric method mg·g-1·h-1

注：原文數(shù)據(jù)為多個生育期的，選擇均值最高的生育期數(shù)據(jù)。

Note:The original paper data is of mutiple growth stages, highest mean value of growth stage is selected.

圖2 保險粉用量對TPF 乙酸乙酯溶液吸光值的影響(5 mL 5 mg·mL-1 TTC，10 mL乙酸乙酯)Fig.2 The effect of Na2S2O4 on ethyl acetate solution with TPF(5 mL TTC 5 mg·mL-1, dissolved in 10 mL ethyl acetate)

3 結(jié)論及建議方案

現(xiàn)有的植物生理學實驗指導中關(guān)于TTC還原法測定根系活力的方法不妥，無論是保險粉2 mg還是“少許”均難以操作。建議標準曲線制作時，在5 mL 5 mg·mL-1TTC溶液中加入0.150～0.200 g保險粉，生成TPF后加乙酸乙酯10 mL，充分振蕩后避光靜置4 h后制成母液。然后吸取4 mL TPF乙酸乙酯溶液定容至10 mL，得到對應于1 mg·mL-1TTC的TPF溶液，最后分別吸取0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至10 mL，獲得分別對應于0.025、0.05、0.10、0.15和0.20 mg TTC的TPF溶液，485 nm下比色，以對應的TTC質(zhì)量為因變量，吸光值為自變量建立標準曲線回歸方程。