張維一，張 井，高晴盈，謝拾冰，王 亮，梁秀美

(溫州市農業(yè)科學研究院，農業(yè)部農產品質量安全風險評估實驗站，浙江溫州 325006)

植物生長調節(jié)劑是一類具有植物激素活性，可影響植物生長發(fā)育的小分子化合物。這類化合物在增強植物抗逆性、促進植物細胞分裂與生長、提高產量以及改善品質等方面具有重要的作用，因而作為高產優(yōu)質高效農業(yè)的一項重要技術措施，已在國內外得到廣泛應用[1-6]。

但在植物生長調節(jié)劑殘留的檢測方法上，蔬菜中檢測標準覆蓋面不全，相關文獻報道較少， 而一些檢測響應較為理想的方法又存在費用高、處理復雜的問題。國內外農藥殘留的檢測技術主要有酶聯免疫法(ELISA) 、氣相色譜法(GC) 、氣相色譜一質譜法(GC-MS) 、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜串聯質譜法(LC-MS)和離子色譜法(IC) 等[5-10]。其中串聯質譜因其優(yōu)異的定性與定量性能越來越得到廣泛應用。而在蔬菜中農藥殘留前處理方法上，近年來QuEChERS方法因其簡單、快速而得到廣泛應用。目前，國內外雖然已有一些采用QuEChERS方法和液相串聯質譜測定植物生長調節(jié)劑殘留的報道[1-6，11]，但是對于同時測定多種性質差異較大的植物生長調節(jié)劑的通用方法報道較少。本研究以液相串聯質譜技術為基礎，通過優(yōu)化QuEChERS方法以及儀器條件，為同時測定多種性質不同的植物生長調節(jié)劑提供相應的簡單、快速、可靠、靈敏的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

XEVO TQS超高效液相色譜質譜聯用儀購自美國WATERS公司，Milli-Q Direct 8 超純水儀購自美國Millipore公司，SK3300HP超聲波清洗器購自上?？茖С晝x器有限公司，MS7610-33 漩渦振蕩器購自美國Thermo Fisher公司， TG16-WS離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司，ROTINA 380離心機購自德國海蒂詩公司，分散勻漿機購自德國IKA集團，AR1502CN電子天平購自奧豪斯儀器有限公司，氮吹儀購自美國Organomation公司。

溶液農藥標準品購自農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所， 固體農藥標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，C18購自德國CNW公司，弗羅里硅土購自美國WZ.der.Floridin公司，石墨化炭黑購自德國CNW公司，545硅藻土購自德國CNW公司，60～200 μm超純硅膠購自加拿大SILICYCLE公司，酸性氧化鋁購自德國CNW公司，堿性氧化鋁購自德國CNW公司，PSA購自德國CNW公司，無水硫酸鎂(分析純)購自西隴化工股份有限公司，乙腈(色譜純)購自德國默克公司，甲醇(色譜純)購自德國默克公司，甲酸(色譜純)購自德國默克公司， 0.22 μm濾膜購自上海安譜實驗科技股份有限公司，實驗室用水為超純水。

1.2 樣品前處理方法

準確稱取10.0 g樣品于離心管中，加入2.5 g無水硫酸鎂，加入φ=1%甲酸-乙腈 10.0 mL，渦旋1 min后6 000 r·min-1離心5 min。取1.0 mL上清液于1.5 mL離心管，加入100 mg 無水硫酸鎂、20 mg硅藻土、50 mg C18，渦旋30 s后10 000 r·min-1離心10 min，0.22 μm濾膜過濾，待LC-MS/MS測定。

1.3 液相串聯質譜條件

超高效液相色譜條件：色譜柱使用HSS T3柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm; 美國WATERS公司)； 流動相A為φ=0.1%甲酸-乙腈溶液，流動相B為φ=0.1%甲酸-水溶液(內含0.1 g·L-1甲酸銨)； 梯度洗脫程序為：0～1 min，5% A；1～2 min，10% A；2～3 min，50% A；3～4 min，90% A；4～5 min，90% A；5～8 min，5% A。流速為0.4 mL·min-1，柱溫40 ℃，樣品進樣量5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正負離子切換掃描；脫溶劑氣流 800 L·h-1脫溶劑溫度為300 ℃，錐孔氣流為150 ℃，鞘氣壓力(氮氣)為7.0 Bar；正離子掃描下毛細管電壓3.90 kV，錐孔電壓25 V；負離子掃描下毛細管電壓1.50 kV，錐孔電壓25 V；數據采集采用多反應監(jiān)測模式(MRM)。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提 取 選擇常見蔬菜大白菜為試驗對象，通過添加回收試驗，考察不同試劑的提取效果。具體過程如下：稱取10 g勻漿樣品3份，添加植物生長調節(jié)劑標物，30 min后加入提取試劑，渦漩1 min，6 000 r·min-1離心5 min，取上清，0.22 μm濾膜過濾，液質檢測，通過計算23種植物生長調節(jié)劑的回收率來考察提取效果。首先考察甲醇、乙腈、乙酸乙酯、水、φ=50%的甲醇水溶液、φ=50%的乙腈水溶液6種試劑的提取能力，具體結果見表1前半部分。試驗結果顯示，水的存在會造成部分疏水性較強的植物生長調節(jié)劑回收率極低。進一步選取甲醇乙腈兩種有機溶劑進行考察[12-14]，并加入2.5 g無水硫酸鎂去除蔬菜中水分，同時考察加入甲酸對于提取效率的影響，結果見表1后半部分。試驗表明，去除水分能明顯改善有機溶劑對目標物的總體提取效果，而乙腈提取的最低回收優(yōu)于甲醇，因此選擇乙腈作為提取溶劑；且乙腈中加與不加甲酸對結果影響極小，酸性環(huán)境下不會降低回收，考慮到樣品本身的復雜性(不局限于大白菜)可能會對回收造成影響，選擇加入甲酸適用性會更廣，因此確定提取試劑為φ=1%甲酸-乙腈，并加入2.5 g無水硫酸鎂。

表1 不同提取劑對23種植物生長調節(jié)劑總體回收情況Table 1 Recovery of 23 plant growth regulators with different extraction solvents

2.1.2 凈化 考察C18、PSA、GCB等常見的固相萃取柱填料對于待測目標物含量的影響。過程如下：取3份待凈化大白菜提取液，添加植物生長調節(jié)劑標物，加入100 mg無水硫酸鎂，加入凈化劑渦旋30 s，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，液質檢測，計算23種植物生長調節(jié)劑的回收率來考察凈化劑對目標物的吸附情況(表2)。8種凈化劑(20 mg)對目標物回收率的中位數較理想，但除C18和硅藻土外，其他凈化劑均存在對少數幾種植物生長調節(jié)劑吸附較強導致最低回收率偏低的情況。進一步考查C18和硅藻土的組合使用量對目標物的吸附情況，分別對20 mg、50 mg的C18、硅藻土以及相應的組合進行添加回收試驗。結果(表2)表明：除50 mg C18+50 mg 硅藻土的凈化劑組合的最低回收小于80%外，其余凈化方案對回收影響均可以接受，且回收情況差異不大；因此選擇50 mg C18+20 mg 硅藻土作為凈化劑。

表2 不同凈化劑凈化后的植物生長調節(jié)劑總體回收情況Table 2 Recovery of 23 plant growth regulators with different purifying agents

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 液相色譜條件 比較3種色譜柱C18柱、T 3柱和Hillc柱(美國Thermo Fisher公司)對23種植物生長調節(jié)劑的保留情況。結果顯示，C18柱對于部分極性較強的植物生長調節(jié)劑保留不理想，Hillc柱對于多數非極性植物生長調節(jié)劑保留能力差，T 3柱對于這23種不同性質的植物生長調節(jié)劑均有較好的保留，因此選用T 3柱。在此基礎上，比較流動相有機相甲醇與乙腈對于分離的影響，發(fā)現選用乙腈作為流動相整體分離效果略好。進一步比較流動相加不加酸對于質譜端響應的影響，發(fā)現加酸能顯著增強部分采用ESI+模式掃描的植物生長調節(jié)劑響應，且并未對ESI-模式掃描的這部分植物生長調節(jié)劑造成大的響應減值；因此流動相有機相確定為φ=0.1%甲酸-乙腈溶液，水相為φ=0.1%甲酸-水溶液(內含0.1 g·L-1甲酸銨)。

2.2.2 質譜條件 優(yōu)化錐孔氣流、毛細管電壓等儀器條件設置、篩選高響應特異離子對等質譜條件，采用正負離子切換掃描多反應監(jiān)測的方式一針進樣完成對所有目標植物生長調節(jié)劑的檢測。具體結果見表3。

2.3 方法評價

2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限 空白樣品中添加一系列濃度的標準物質，每個質量濃度6次重復，計算線性范圍，并以目標物質量濃度為縱坐標(y，單位為 μg·L-1)，質譜定量離子的峰面積為橫坐標(x)來繪制標準曲線，具體結果見表4。試驗結果表明，各目標物線性關系良好，線性范圍較寬。

根據信噪比(S/N=3)確定方法檢出限，根據信噪比(S/N=10)以及線性范圍確定方法定量限(表4)。試驗結果表明，檢出限范圍為0.007 1～4.3 μg·kg-1，定量限范圍為0.024～14 μg·kg-1，多數植物生長調節(jié)劑檢出限和定量限在1.0 μg·kg-1以下，該方法對23種植物生長調節(jié)劑的檢測靈敏度較高。

表3 23種植物生長調節(jié)劑的質譜參數Table 3 Mass spectrometric conditions for 23 kinds of plant growth regulators

2.3.2 基質效應 采用相對響應值法對此進行評價(基質效應=空白基質標準響應值/純溶劑標準響應值)，基質效應大于1為基質增強效應，反之則為基質抑制效應[15]；對41種蔬菜進行基質效應評價，試驗結果表明，23種植物生長調節(jié)劑在這41種蔬菜中平均基質效應為0.49，其中92%的情況為基質抑制，基質效益為0.007 5～2.0，基質效應對這一系列植物生長調節(jié)劑的質譜響應影響較大，因此必須通過使用基質配置標準溶液或添加同位素內標的方式來消除基質效應影響。

2.3.3 方法的準確度與精密度 對大白菜等蔬菜樣品進行低質量濃度加標回收試驗以考察方法的準確度，同時計算6次重復的相對標準偏差來考察該方法在目標物低質量濃度條件下的精密度，具體結果見表5。

試驗結果表明，在10倍定量限的加標水平下，23種植物生長調節(jié)劑平均回收率為73.1%～121.3%，在70%～130%內，且大部分平均回收率為80%～100%，總體情況良好，準確度符合試驗要求。相對標準偏差多數小于5%，方法精密度較為理想；但甲哌啶等4種植物生長調節(jié)劑相對相對標準偏差大于10%，雖符合15%的試驗基本要求，也提示這幾種植物生長調節(jié)劑在試驗過程中可能存在結果不穩(wěn)定的情況。

表4 23種植物生長調節(jié)劑的標準曲線、相關系數、檢出限和定量限Table 4 Linearity,LOD and LOQ of 23 plant growth regulators

表5 23種植物生長調節(jié)劑的加標平均回收率及相對標準偏差Table 5 Average recovery and relative standard deviation of 23 plant growth regulators

2.4 實際樣品分析

使用本研究的試驗方法對市場和基地抽檢的15個芹菜、25個絲瓜、30個茭白共計70個樣品進行檢測驗證?？傮w上，脫落酸的檢出率為40%，在3種蔬菜中檢出率均極高，但質量濃度較低，幾乎都在10 μg·kg-1以下，考慮來源為蔬菜內源激素。其中芹菜中檢出較高的有矮壯素(13.3%)和赤霉素(6.7%)，絲瓜中檢出較高的為氯吡脲(32%)和5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉(16%)，茭白中檢出較高的主要有矮壯素(36.67%)，檢出的農藥類型及含量情況基本與這幾種蔬菜的生產用藥情況相符，說明該方法準確可靠。

3 結論與討論

選取性質相差較大的23種植物生長調節(jié)劑為目標，通過優(yōu)化QuEChERS提取及凈化方法，得到對這23種植物生長調節(jié)劑進行同時提取較為合適的前處理方法，但具體到單個植物生長調節(jié)劑并非最佳方法，而是一種通用性較好的前處理方式；同時在凈化上對一些QuEChERS不常用的材料進行嘗試，找到一組較為理想的凈化試劑組合；通過對色譜柱、流動相等液相端及離子對等質譜端條件的優(yōu)化，進一步使該方法能同時滿足一次性檢測性質相差較大目標物。此外，通過基質加標回收等方法驗證得到令人滿意的方法評價參數。相對于傳統(tǒng)方法，本方法簡單、快速、有效，能夠同時測定蔬菜中性質相差較大的23種植物生長調節(jié)劑，極大節(jié)約分析時間和成本。