黃可婷 金多晨 黨旖旎 張國新

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科(210029)

胃癌是全球第二大腫瘤相關(guān)死亡原因，5年生存率小于25%[1]。動物模型能模擬體內(nèi)胃癌發(fā)生、轉(zhuǎn)化、侵襲等一系列生物學(xué)特性，是研究胃癌及其潛在機制的重要工具。近年來，隨著基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因工程小鼠模型的運用越來越廣泛。這種小鼠模型往往用于探究特定基因型與疾病表型的關(guān)聯(lián)，極大地豐富了對宿主基因功能和疾病遺傳特征的理解。本文就常見的基因工程小鼠胃癌模型作一綜述。

一、胰島素-胃泌素(insulin-gastrin, INS-GAS)小鼠

INS-GAS小鼠是應(yīng)用最為廣泛的腸型胃癌模型，其轉(zhuǎn)基因序列由人胃泌素編碼序列上游的胰島素啟動子組成。小鼠早期表現(xiàn)為高胃泌素血癥、胃萎縮，隨后向腸化生和異型增生發(fā)展，20月齡時75%發(fā)生胃體侵襲性腫瘤[2]。幽門螺桿菌(Hp)是INS-GAS小鼠的Ⅰ類致癌物，Hp感染后小鼠腸化生明顯加快，且易發(fā)生黏膜內(nèi)浸潤和血管浸潤[2]。由于致癌閾值低，重現(xiàn)性好，Hp感染的INS-GAS小鼠是較為理想的胃體腫瘤模型。

目前，這種小鼠模型主要用于研究胃癌的發(fā)病機制、干預(yù)治療、菌群共生等。Hp感染促進(jìn)小鼠體內(nèi)胃泌素表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞尤其是壁細(xì)胞凋亡[3]。同時，Hp感染可抑制小鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域1(nucleotide-binding oligomerization domain containing 1, Nod1)受體表達(dá)，改變巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，加重?fù)p傷反應(yīng)[4]。作為藥物治療模型，INS-GAS小鼠已獲得良好的應(yīng)用。有研究[5]將雌二醇聯(lián)合他莫昔芬治療小鼠胃癌，證實了雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在胃癌中的作用。經(jīng)化療藥物吉非替尼干預(yù)后，INS-GAS小鼠體內(nèi)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)受到抑制，提示吉非替尼對胃癌有潛在的治療效應(yīng)[6]。此外，對不同感染狀態(tài)下INS-GAS小鼠的研究[3]發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌協(xié)同Hp感染可誘導(dǎo)胃癌的發(fā)生。三種腸道細(xì)菌(包括ASF356梭菌屬、ASF361乳桿菌屬和ASF519擬桿菌屬混合物)促進(jìn)INS-GAS小鼠胃部病變，Hp感染可加速病變進(jìn)展[7]。最近一項評估Hp感染后小鼠胃黏膜譜系變化的研究[8]結(jié)果表明，Hp主要啟動胃中解痙多肽表達(dá)型化生(spasmolytic polypeptide-expressing metaplasia, SPEM)，進(jìn)一步腸道細(xì)菌感染可促進(jìn)凹陷性增生、腸化生和血管侵襲。上述研究結(jié)果提示，Hp誘導(dǎo)INS-GAS小鼠發(fā)生胃癌需要額外細(xì)菌的作用，腸道細(xì)菌定植可能是胃癌發(fā)生的另一重要原因。

二、TFF1基因敲除(TFF1-/-)小鼠

TFF1(又稱pS2)屬三葉肽家族成員，具有黏膜保護(hù)和修復(fù)的作用。TFF1-/-小鼠最早由Lefebvre等[9]通過同源重組技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建，所有小鼠均發(fā)展為胃竇和幽門腺瘤，30%發(fā)展為多灶性上皮內(nèi)癌或黏膜內(nèi)癌。Hp與TFF1沉默表達(dá)具有協(xié)同作用，Hp感染后TFF1-/-小鼠胃腺癌的發(fā)生率顯著增加[10]。體外實驗表明，TFF1能與Hp相互作用特異性結(jié)合人胃黏蛋白，促進(jìn)細(xì)菌在胃黏液層中的定植[11]。該現(xiàn)象解釋了細(xì)菌對胃組織的趨向性，但尚缺乏體內(nèi)證據(jù)，需進(jìn)一步研究來闡明兩者之間的關(guān)系。

TFF1-/-小鼠模型常用于免疫細(xì)胞浸潤、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等促癌機制的研究。與野生型小鼠相比，TFF1-/-小鼠胃竇組織中存在大量T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，TFF1沉默是胃內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)鍵步驟[12]。研究表明，多種信號通路通過介導(dǎo)TFF1參與胃癌的發(fā)生。TFF1基因沉默可激活腫瘤壞死因子α/IκB激酶(TNF-α/IKK)途徑，促進(jìn)NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[13]。通過調(diào)節(jié)AKT-GSK-3β軸，TFF1沉默促進(jìn)β-連環(huán)蛋白活化，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤的形成[14]。在炎-癌轉(zhuǎn)化過程中，EMT與TFF1表達(dá)相關(guān)。胃損傷誘導(dǎo)TFF1表達(dá)上調(diào)，最終觸發(fā)EMT參與黏膜損傷的修復(fù)[15]。TFF1在炎癥中表達(dá)增高而在腫瘤中表達(dá)沉默。最近一項檢測胃黏膜變化的研究[16]發(fā)現(xiàn)，Hp急性感染期(<2周)TFF1表達(dá)上調(diào)以抑制炎癥；當(dāng)感染持續(xù)存在時，TFF1表達(dá)下降直至沉默。發(fā)生其他消化系統(tǒng)腫瘤(如胰腺腫瘤)時，TFF1-/-小鼠亦可檢測出EMT表型[17]。然而，胃癌中TFF1與EMT之間的關(guān)聯(lián)尚未見報道。

三、Gp130敲入突變(gp130757F/F)小鼠

Gp130757F/F小鼠由敲入點突變產(chǎn)生，該突變將細(xì)胞內(nèi)gp130 757位置上酪氨酸殘基(Y)轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸殘基(F)，可阻斷SHP-2/Ras/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。Gp130757F/F小鼠體內(nèi)TFF1表達(dá)缺失，病理表現(xiàn)與TFF1-/-小鼠類似，3個月時進(jìn)展為胃腺瘤，成瘤率100%[19]。Gp130受體主要觸發(fā)下游三種信號途徑，即JAK/STAT、SHP-2/ERK/MAPK和Src/PI3K/AKT。Hp通過細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(cytotoxin-associated gene A protein, CagA)影響不同通路的活性，磷酸化的CagA激活SHP2/ERK，而未磷酸化的CagA激活JAK/STAT3途徑[20]。

Gp130757F/F小鼠模型主要用于研究gp130配體在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。細(xì)胞因子白細(xì)胞介素11(interleukin-11, IL-11)和IL-6是gp130的主要配體。IL-11通過經(jīng)典途徑激活STAT1/3，是gp130信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子[21]。作為潛在的治療靶點，IL-11通過gp130/JAK/STAT3/Bcl-2途徑參與胃癌化療藥物的耐藥作用，靶向IL-11治療可能是克服耐藥的新策略[22]。IL-6在胃竇中的活性較低，與腫瘤侵襲相關(guān)，而與腫瘤生長無關(guān)[23]。除炎癥反應(yīng)外，宿主免疫應(yīng)答在腫瘤進(jìn)展過程中亦發(fā)揮重要作用。免疫相關(guān)基因Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)可被STAT3激活，以不依賴炎癥的方式調(diào)節(jié)胃腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡[24-25]。最新研究[26]還發(fā)現(xiàn)，gp130757F/F小鼠胃竇黏膜下層富含淋巴樣的聚集體，其中g(shù)p130/STAT3信號軸可驅(qū)動體內(nèi)胃腫瘤的三級淋巴結(jié)構(gòu)發(fā)展，促進(jìn)胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。Gp130757F/F小鼠遵循經(jīng)典的腸型胃癌發(fā)展序列，與人類腫瘤相似度極高，研究胃癌免疫細(xì)胞的免疫效應(yīng)以及轉(zhuǎn)移和侵襲性表型可選擇該模型。

四、H/K-ATPase-IL-1β小鼠

IL-1β是一種多效的促炎因子，具有強烈的抑酸作用。通過抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放，IL-1β可抑制Sonic Hedgehog(Shh)基因表達(dá)[27]。Shh是Hedgehog蛋白家族成員，能調(diào)節(jié)胃上皮細(xì)胞分化，誘導(dǎo)胃內(nèi)氫-鉀-ATP酶(H/K-ATPase)表達(dá)。利用鼠H/K-ATPase啟動子構(gòu)建特異性表達(dá)人IL-1β的小鼠模型，即H/K-ATPase-IL-1β小鼠[28]。該小鼠表現(xiàn)為自發(fā)性胃炎、胃萎縮、腸化生，直至進(jìn)展為胃癌。Hp與IL-1β協(xié)同參與胃腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。與IL-1β作用類似，Hp感染抑制壁細(xì)胞Shh表達(dá)和H/K-ATPase轉(zhuǎn)錄[27]。敲除小鼠IL-1β基因，Hp感染引起的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞募集減少，NF-κB活化減少[28]。由此推測，IL-1β可能是Hp感染的最終致病途徑。

H/K-ATPase-IL-1β小鼠模型目前被廣泛用于研究腫瘤早期的啟動機制、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)以及基質(zhì)細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的作用。通過激活NF-κB途徑，IL-1β募集胃內(nèi)骨髓來源抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)[28]，對早期腫瘤的發(fā)生具有重要作用。至少20%的CAFs來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。IL-1β可誘導(dǎo)CAFs中的信號傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤向胞外基質(zhì)和淋巴管侵襲[29]。在此過程中，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1募集MDSCs，促進(jìn)胃異型增生[30]。此外，H/K-ATPase-IL-1β小鼠是檢測胃癌表觀遺傳學(xué)變化的重要工具。IL-1β可直接誘導(dǎo)胃腫瘤細(xì)胞的DNA甲基化[31]，表明炎癥因子可直接觸發(fā)表觀遺傳學(xué)變化來促進(jìn)胃病發(fā)展，揭示了炎癥與胃癌之間的新機制。

五、其他

原癌基因K-ras的激活涉及多種惡性腫瘤的發(fā)生。將特異表達(dá)于胃頸/峽部的角蛋白19(keratin 19, K19)與K-ras融合，構(gòu)建K19-K-ras-V12突變模型。結(jié)果顯示小鼠3個月時出現(xiàn)泌酸腺萎縮和黏液性化生，20月齡發(fā)生高度異型增生和黏膜下浸潤[32]。另一種K-ras突變模型由CK19CreERT基因插入LSL-K-rasG12D小鼠構(gòu)成，這種小鼠早期出現(xiàn)SPEM、腸化生和胃祖細(xì)胞激活現(xiàn)象，與人癌前病變相似[33-34]。因此，具有K-ras突變的小鼠模型常用于研究早期胃癌的分子事件。

K19-Wnt1小鼠胃黏膜能特異表達(dá)Wnt1蛋白、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2, COX-2)和前列腺素E2[35]。K19-Wnt1小鼠與K19-C2mE小鼠雜交生成K19-Wnt1/C2mE小鼠，5周齡時可發(fā)生黏液性化生，20周齡時形成胃腫瘤[35]。這種小鼠模型主要用于探索Wnt途徑、COX-2和血管抑制素2等在胃癌生成中的機制[36]。

Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)是鋅指轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞。KLF4敲除(KLF4-/-)小鼠由Villin-Cre+小鼠和Klf4fl/fl小鼠雜交培育而成，病理表現(xiàn)為胃上皮細(xì)胞增殖增加和分化改變，35周齡時形成胃竇前腫瘤，80周齡時29%小鼠發(fā)生胃竇腫瘤[37]。這種模型可用于胃竇干細(xì)胞誘導(dǎo)的自發(fā)性腫瘤研究。

六、結(jié)語

理想的動物模型是研究胃癌發(fā)病機制和改進(jìn)治療策略的重要前提?；蚬こ绦∈笾苯訉⒄{(diào)控胃癌的特定基因轉(zhuǎn)染至胚胎組織中形成原發(fā)性腫瘤，其腫瘤進(jìn)展過程和形態(tài)特征與人類腫瘤相似(表1)。這些小鼠對研究基因突變、信號通路、藥物研發(fā)以及藥效評估具有獨特的優(yōu)勢，是極為理想的實驗?zāi)Ｐ汀＝陙?，基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被用于構(gòu)建各種基因修飾的動物模型。有研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建TFF-/-小鼠，這種新培育的模型的病理表型與以往研究一致[38]。另一項研究[39]則在gp130757F/F小鼠中敲除凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)，從而探討胃癌發(fā)生的新機制。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)的基因工程小鼠模型，可從分子水平進(jìn)行單基因或多基因的敲除，避免既往單基因突變模型帶來的缺陷，更貼近人類腫瘤發(fā)生的特點，有望成為未來腫瘤研究的主流工具。本文從小鼠模型的造模方式、病理表型、與Hp感染的相關(guān)性、適用領(lǐng)域等角度進(jìn)行總結(jié)，對胃癌的基礎(chǔ)研究具有重要的參考價值。

表1 基因工程小鼠胃癌模型匯總