才興蔓

（遼寧省葫蘆島市龍港區(qū)雙樹動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧葫蘆島 125101）

1 分離實驗部分

1.1 材料

（1）病料來源

某肉種雞場30周齡羅斯308種雞10只。無菌條件下剖檢取病雞的心、肝、脾、腎等實質臟器3份，置冰箱4℃保存，備用。

（2）培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂平板、兔鮮血營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面、半固體營養(yǎng)瓊脂均按常規(guī)方法[9、10、11]自行配制。

（3）微量發(fā)酵管

糖微量發(fā)酵管由杭州天和微生物試劑有限公司提供。

（4）藥敏試紙

藥敏試紙由杭州天和微生物試劑有限公司提供。

（5）抗O因子血清

大腸桿菌標準O1、O2、O35、O78血清型均購自揚州大學農業(yè)部畜禽傳染病學重點實驗室。

（6）實驗動物

小白鼠由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供，每只體重約20g，31周齡羅斯308肉種雞由大連莊河金泉種禽繁育有限公司提供，每只體重約3kg。

（7）主要儀器與設備

JP-A型架盤天平、自動立式電熱蒸氣壓力消毒器（YX-350型）、DHG-9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱、打孔器恒溫箱、凈化臺（超凈工作臺SW-CJ-IF型）、0.5號麥氏單位膠乳濁度比濁管新華一號定性濾紙、顯微鏡、染缸、可調式微量移液器、玻璃儀器。

1.2 方法

（1）病料的采集

在剖檢病雞時無菌取病雞的心、肝、脾、腎等實質臟器3份，置冰箱4℃保存，備用。

（2）細菌的分離培養(yǎng)

①平板劃線分離培養(yǎng) 細菌的分離培養(yǎng)方法有劃線法和傾注法兩種，本實驗采用劃線法。無菌條件下將病料分別接種于普通肉湯37℃培養(yǎng)24h后，接種于麥康凱瓊脂平板，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

②細菌的純化 觀察麥康凱瓊脂平板上分離培養(yǎng)的菌落，選純紅色典型菌落，標記后，接種營養(yǎng)肉湯進行純培養(yǎng)，24h后接種普通營養(yǎng)瓊脂斜面，進一步接種伊紅美蘭瓊脂、SS瓊脂、血液瓊脂平板37℃培養(yǎng)24h。

（3）細菌的形態(tài)學觀察

細菌標本片制作的基本步驟：觸片→干燥→固定→染色→鏡檢。

（4）生化試驗

取細菌純培養(yǎng)物接種五種糖類微量發(fā)酵管（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發(fā)酵管），置37℃培養(yǎng)48h后進行觀察。并按常規(guī)方法接種三糖鐵瓊脂斜面和進行吲哚試驗、M-R試驗、V-P試驗、半固體營養(yǎng)瓊脂穿刺試驗并觀察試驗結果。

（5）藥物敏感試驗

①菌液準備 釣取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上單個菌落，接種于普通肉湯，37℃ 培養(yǎng)l0h，其濁度相當于0.5號麥氏標準，此時肉湯中活菌數為1X108CFU/mL。如肉湯中細菌濁度超過0.5號麥氏標準，用無菌生理鹽水或營養(yǎng)肉湯稀釋至0.5號麥氏標準相同的濁度。

②接種平板 用無菌棉簽吸取調節(jié)好濃度的菌液，在營養(yǎng)瓊脂平板表面涂抹接種，務必將細菌菌液涂布均勻。

③在瓊脂平板上貼加抗菌藥敏片 用滅菌尖頭鑷子夾取各種抗菌藥藥敏紙片，按一定密度分別貼到上述已涂布細菌的培養(yǎng)基表面，用鑷子清壓，確保藥敏紙片與瓊脂表面完全接觸.紙片貼完15 min后將平板翻轉過來，底部在上，置37℃ 恒溫箱內培養(yǎng)l8h，取出觀察，記錄結果。

（6）分離血清型鑒定

挑取純培養(yǎng)的菌落接種于液體（處理過的肉湯）培養(yǎng)基，37%培養(yǎng)12h后煮沸2h，經500Or/min，棄去上清，加入生理鹽水作適度稀釋。用一張清潔的玻板，取標準抗“O”單因的凝集現象。同時用生理鹽水代替血清做對照組。

2 實驗結果鑒定部分

2.1 細菌分離培養(yǎng)

在營養(yǎng)瓊脂上37℃培養(yǎng)24～48h后，形成中等大小、圓形微凸起、表面光滑濕潤、半透明灰白色菌落；在麥康凱瓊脂上形成中等大小，表面光滑濕潤的磚紅色菌落；在伊紅美藍瓊脂上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落；在SS瓊脂上生長較差呈紅色；在血液瓊脂上出現菌落較大，有粘性邊緣整齊、并有隆起的灰白色菌落，呈完全溶血；分離菌在肉湯中培養(yǎng)18～24 h，呈均勻混濁，管底有淡白色粘稠沉淀，部分菌株可在肉湯表面形成菌環(huán)。

2.2 細菌形態(tài)學觀察

病雞心、肝腎等組織培養(yǎng)物涂片、染色、鏡檢，均可見兩端鈍圓，多數散在排列，偶爾有2～3個連在一起的革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 生物化學試驗

生化試驗結果顯示，細菌在三糖鐵培養(yǎng)基上生長表面產酸，底部產酸產氣，不產生H2S，初步鑒定是大腸桿菌。從表1可以看出，此次分離的大腸桿菌對葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖酵解產酸產氣，M-R和靛基質試驗、運動性試驗結果陽性，V-P、枸櫞酸鹽利用試驗呈陰性，符合大腸桿菌的生化特性[8]。

2.4 藥敏試驗結果

藥敏實驗結果根據抑菌圈的大小可見：該菌對阿米卡星、恩諾沙星極度敏感；對卡那霉素、慶大霉素、氟苯尼考高度敏感；對環(huán)丙沙星、沙拉沙星、阿莫西林中度敏感；對諾氟沙星、土霉素低度敏感；對頭孢唑啉鈉、新霉素、紅霉素、新諾明、氨芐西林不敏感。

2.5 分離菌的血清型鑒定

根據玻版的凝集情況顯示：本次實驗分離到的致病性大腸桿菌菌株主要為O78型。