李浩然 曲 蕾 孫豐盛 郭霧晴 孫浩偉 王 鑫

（臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276005）

體細(xì)胞克隆技術(shù)是指把動(dòng)物體細(xì)胞經(jīng)過(guò)抑制培養(yǎng)，使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)。采用核移植的方法，利用細(xì)胞拆合或細(xì)胞重組技術(shù)，將卵母細(xì)胞去核作為核受體，以體細(xì)胞或含少量細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞核即核質(zhì)體作為核供體，將后者移入前者中，構(gòu)建重組胚，供體核在去核卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中重新編程，并啟動(dòng)卵裂，開(kāi)始胚胎發(fā)育過(guò)程，妊娠產(chǎn)仔，克隆出動(dòng)物的技術(shù)，又可稱之為體細(xì)胞核移植技術(shù)。

1 背景

自1996年7月5日，英國(guó)科學(xué)家伊恩·維爾穆特博士用一個(gè)成年羊的體細(xì)胞成功克隆出“多莉羊”，“克隆”一詞開(kāi)始走進(jìn)了大眾的視野。隨著“多莉羊”被克隆出，許多哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞克隆動(dòng)物也相繼誕生，但是與人相近的靈長(zhǎng)類動(dòng)物的體細(xì)胞克隆技術(shù)一直沒(méi)有成功過(guò)[1]，沒(méi)有克隆猴，就很難建立模擬人類疾病的動(dòng)物模型。而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如小白鼠，大白兔等，作為一部分特殊的動(dòng)物群體，在人類疾病研究等方面做出了巨大的貢獻(xiàn)，但是這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人之間的巨大物種差異使得目前大多數(shù)利用小白鼠、大白兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為研究對(duì)象獲得的研究成果不能被直接用于人類疾病的臨床治療[2]，而倫理與現(xiàn)實(shí)的制約因素也使得直接以人為研究對(duì)象變得不可行。因此，建立與人類最為接近的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，成為科學(xué)家們亟待解決的問(wèn)題。

2 體細(xì)胞克隆猴技術(shù)

早在1997年，美國(guó)Don Wolf實(shí)驗(yàn)室用6-16細(xì)胞時(shí)期早期胚胎細(xì)胞作為核供體細(xì)胞功克隆出一雌一雄兩只恒河猴。而關(guān)于非人靈長(zhǎng)類體細(xì)胞克隆工作的研究報(bào)道最早是出現(xiàn)在2002年[3]，之后不同國(guó)家的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)體細(xì)胞克隆猴這一技術(shù)進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，但都沒(méi)有成功。2017 年中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所非人靈長(zhǎng)類研究平臺(tái)團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)5年攻關(guān)，終于突破了這一世界性難題。他們利用體細(xì)胞克隆技術(shù)成功地獲得了2只克隆猴“中中”和“華華”。這是人類歷史上首次使用體細(xì)胞作為供體獲得的克隆非人靈長(zhǎng)類后代，其成功不僅在生物學(xué)研究領(lǐng)域具有“里程碑式”的意義，而且對(duì)提升非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利也有重要幫助。

3 體細(xì)胞克隆猴技術(shù)存在的問(wèn)題及三大難點(diǎn)

目前，科隆率低是克隆技術(shù)存在的最大問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，牛的效率為10%～20%，山羊?yàn)?%～10%，而小鼠的克隆效率僅有4～5%，而導(dǎo)致體細(xì)胞克隆效率低下的主要原因是克隆動(dòng)物常常出現(xiàn)的“三高”，即克隆胎兒流產(chǎn)率高、圍產(chǎn)期死亡率高、新生動(dòng)物死亡率高[4]。此外，克隆動(dòng)物胚胎、胎兒發(fā)育異常，克隆動(dòng)物發(fā)育缺陷等也是克隆技術(shù)中存在的較為嚴(yán)重的問(wèn)題。

體細(xì)胞克隆猴有三大難點(diǎn)：一是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所提供的卵母細(xì)胞的細(xì)胞核不易辨別，這導(dǎo)致去核的難度增大，作為受體細(xì)胞，要將細(xì)胞核“摘除”才能容納“外來(lái)細(xì)胞核”若去核不成功，無(wú)法保證所有的核遺傳物質(zhì)全來(lái)自與供體所提供的細(xì)胞核。二是在卵母細(xì)胞進(jìn)行核移植前卵母細(xì)胞處于“沉默”狀態(tài)，而難點(diǎn)就在這里，卵細(xì)胞容易提前被激活，在克隆過(guò)程中，在體細(xì)胞進(jìn)入卵細(xì)胞時(shí)才將卵細(xì)胞激活后而進(jìn)行一系列的發(fā)育過(guò)程，這就需要卵細(xì)胞被激活的時(shí)間要精準(zhǔn)，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，若采取傳統(tǒng)的激活方法，難以控制“時(shí)機(jī)”，進(jìn)而使實(shí)驗(yàn)的難度增大。三是對(duì)于體細(xì)胞克隆來(lái)說(shuō)，體細(xì)胞的全能性較胚胎細(xì)胞的全能性較低，這使得胚胎的發(fā)育率較低。

4 體細(xì)胞克隆猴技術(shù)的意義及前景

隨著人類科學(xué)的不斷進(jìn)步，對(duì)于利用高等動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象開(kāi)展相關(guān)研究的需求與日俱增，其中非人靈長(zhǎng)類占有很大的比例。由于沒(méi)有遺傳背景均一的近交系猴，因此只能通過(guò)使用更多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)消除因個(gè)體間差異而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。體細(xì)胞克隆猴技術(shù)不僅可以幫助我們得到一群基因背景近乎一致的猴子，極大地克服了靈長(zhǎng)類動(dòng)物之間個(gè)體差異大、實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性差等缺陷，還可對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行定向基因打靶，通過(guò)一系列篩選步驟篩選出陽(yáng)性克隆后將其用作核移植的供體細(xì)胞，從而克隆出特定的疾病模型猴并進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)疾病的研究。最后，由于疾病模型猴的基因背景一致，可大大減少生物醫(yī)療領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的使用量，幫助篩選人類疾病的有效藥物，縮減新藥研發(fā)、臨床實(shí)驗(yàn)等的周期和費(fèi)用，從整體上提升非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。克隆猴的成功意味著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)科發(fā)展到了一個(gè)新的高度。體細(xì)胞克隆猴的成功對(duì)于自閉癥，老年癡呆癥，帕金森綜合征及其他退行性疾病患者來(lái)說(shuō)，都是一個(gè)極大福音。

5 討論

科學(xué)技術(shù)的發(fā)展為人類在各項(xiàng)領(lǐng)域的研究提供了嶄新的思路，推動(dòng)著人們?nèi)ヌ剿鞲嗟奈粗澜?，正如克隆技術(shù)被發(fā)現(xiàn)后，使得生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了巨大的突破，但是，人們?cè)跉g欣鼓舞的同時(shí)，也存在著隱隱的不安：是不是終有一天人也會(huì)被克隆？其實(shí)這已經(jīng)不需要回答了，從“多莉羊”誕生再到體細(xì)胞克隆猴技術(shù)的成功，人們就已知道，克隆人不再是一個(gè)理論難題，技術(shù)層次的突破只是一個(gè)時(shí)間的問(wèn)題，那么我們應(yīng)該如何去處理這中間存在的諸多問(wèn)題，譬如倫理道德問(wèn)題？事實(shí)上，早在“多莉羊”誕生以來(lái)，圍繞克隆技術(shù)的倫理問(wèn)題的爭(zhēng)論就從未停止過(guò)，正確把握科研需要與倫理道德之間的平衡，將是未來(lái)科研工作者必須具備的一項(xiàng)基本素質(zhì)。

我國(guó)在2003年發(fā)布的《人胚胎干細(xì)胞研究倫理指導(dǎo)原則》中就明確規(guī)定：禁止進(jìn)行生殖性克隆人的任何研究。我國(guó)目前科研倫理規(guī)范主要有以下三個(gè)文件，分別是國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)于2016年10月發(fā)布的《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》，原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于2003年6月發(fā)布的《藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范（GCP）》以及2012年中國(guó)疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的《關(guān)于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和國(guó)際合作項(xiàng)目中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查規(guī)定（試行）》[5]，我國(guó)進(jìn)行的體細(xì)胞克隆猴技術(shù)是在嚴(yán)格的倫理規(guī)范下進(jìn)行的。當(dāng)然，涉及到人類延續(xù)和發(fā)展的倫理問(wèn)題時(shí)，還是需要在更加謹(jǐn)慎的思考和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)查下進(jìn)行，相信在不久地將來(lái)，會(huì)有更加健全的法律法規(guī)出臺(tái)，在正確的法律規(guī)范和道德觀念的引導(dǎo)下，體細(xì)胞克隆技術(shù)會(huì)迎來(lái)更加廣闊的研究前景并為人類疾病研究帶來(lái)巨大福音。