林 田 曹慧慧 龐學(xué)良 湯思凝

（1.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北唐山 063000；2.河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，河北唐山 063000）

隨著技術(shù)的進步與發(fā)展，豬肉中微生物的檢測手段也在不斷發(fā)生著變化，逐漸實現(xiàn)從傳統(tǒng)培養(yǎng)方法到分子方法的轉(zhuǎn)變和過渡。為此，文章就豬肉微生物常用的四種檢測手段進行分析和闡述。由此可見，關(guān)于“PCR技術(shù)在豬肉中微生物檢測應(yīng)用”的研究和分析顯得尤為重要。

1 PCR技術(shù)的發(fā)展歷程分析

關(guān)于PCR技術(shù)的發(fā)展歷程，整體上來說可以分為以下幾個主要階段：

1.1 一代PCR

關(guān)于PCR的研究，可以說是從1985年開始的，在其產(chǎn)生之初，相對于傳統(tǒng)的方法來說，這種技術(shù)具有更強的選擇性，靈敏度也更加理想，只是由于剛剛起步，在引物的設(shè)計上還是存有缺陷，導(dǎo)致在進行檢測的時候，容易出現(xiàn)假性的陽性反應(yīng)，因此在檢測的適用性上局限性較強，在定性的食源性微生物和半定量的食源性微生物應(yīng)用更為廣泛。

1.2 二代PCR

相對于一代PCR而言，技術(shù)更加成熟，所發(fā)生的變革也是實質(zhì)性的，也逐步實現(xiàn)了從定性到定量的轉(zhuǎn)變，技術(shù)也更加成熟，也正是因為如此，能夠?qū)崿F(xiàn)對樣本中的目標DNA準確量化，而熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理則是其原理和基礎(chǔ)。

1.3 三代PCR

隨著需求的不斷提升，定量PCR技術(shù)由于多種因素的影響，也很容易影響到DNA的擴增過程，因此定量僅僅是相對性的，在這樣的情形和背景下，“絕對定量”的新技術(shù)應(yīng)運而生。這項嶄新的技術(shù)具體來說就是將限度一定的稀釋樣品分布到反應(yīng)單元中，會有微反應(yīng)的發(fā)生，然后導(dǎo)致每一個反應(yīng)單元出現(xiàn)一個甚至更多的拷貝目標分子，然后通過擴增技術(shù)和熒光信號分析，準確計算出DNA的分子密度。

PCR技術(shù)在歷經(jīng)了發(fā)展之后，逐漸趨于成熟，但是依然有缺陷，最為主要的就是系統(tǒng)的開放，很容易導(dǎo)致擴增之后的PCR產(chǎn)物對環(huán)境造成污染；再加上系統(tǒng)是手動的，所耗費的人力也是巨大的。

2 PCR技術(shù)在豬肉微生物檢測中的應(yīng)用分析

PCR技術(shù)在豬肉微生物檢測中的應(yīng)用是體現(xiàn)在多個層面的：

2.1 PCR技術(shù)與豬肉中沙門氏菌的檢測

沙門氏菌的本質(zhì)是一種食源性的病原體，而且還是全球性的，在我國內(nèi)陸地區(qū)其疾病爆發(fā)往往也是以其為主的，豬肉作為其主要的來源，如何快速做好檢測具有重要的作用和積極意義。

這種檢測可以以沙門氏菌的基因設(shè)計引物和探針為基礎(chǔ)，建立檢測方法，這種方法含有擴增內(nèi)標的生鮮豬肉，檢測的周期往往在12h內(nèi)，而且不容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。

還有的專家經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，如果用濃度為0.1%的脫氧膽酸鈉和40μg/ml的PMA會導(dǎo)致協(xié)同作用的產(chǎn)生，能夠有效抑制沙門氏菌死菌的PCR擴增，但是對于活菌DNA的擴增卻不會產(chǎn)生任何抑制作用。

2.2 PCR技術(shù)與豬肉中大腸桿菌的檢測

大腸桿菌能夠?qū)е氯顺霈F(xiàn)出血性腹瀉或者是腸炎，牛、羊和豬都是大腸桿菌的主要寄宿主。檢測的時候，設(shè)計六對具有特異性的引物和與之相適應(yīng)的探針，檢測快速，而且特異性理想，應(yīng)用方便。

2.3 PCR技術(shù)與豬肉中單核細胞增生李斯特氏菌的j檢測

這種細菌致病性強，很容易誘發(fā)腦膜炎或者是導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)等，而且這種細菌的存活能力強，生長繁殖旺盛，在進行檢測的時候，經(jīng)過必要的優(yōu)化處理，可以實現(xiàn)春軍培養(yǎng)物檢測靈敏度的顯著改善和提升。

2.4 PCR技術(shù)與豬肉中金黃色葡萄球菌的檢測

檢測的具體手段就是將金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因作為靶基因，結(jié)合平板計數(shù)的方法，建立熒光定量檢測方法。依托實驗的結(jié)果，當進入到穩(wěn)定期以后，相對于傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法而言，這種檢測的結(jié)果更高，而且相對于傳統(tǒng)的PCR檢測方法而言，這種檢測效果更加理想，檢測水平也更高。

3 結(jié)語

從上文的論述中，我們對于PCR檢測技術(shù)的發(fā)展有了更加深入的了解和研究，也明確了其在豬肉微生物檢測中的實際應(yīng)用。從總體情況上來看，如果單純應(yīng)用PCR技術(shù)的話，還是存有一些缺陷的，具體的體現(xiàn)就是如果說病原性微生物變異性高的話，依然會容易出現(xiàn)一些假性的陽性結(jié)果；另外就是這種技術(shù)尚且不能用于擴增產(chǎn)物大小的檢測，目前關(guān)于這個層面的研究尚且還不夠成熟與完善。

基于上述缺陷，在未來的研究中，可以從以下幾個方面著手展開研究：第一個就是在前處理階段，如何進行凍融技術(shù)和超聲技術(shù)以及搖床等技術(shù)的綜合性應(yīng)用；第二個就是在提取DNA的階段，如何實現(xiàn)與DNA提取試劑盒等的結(jié)合應(yīng)用；第三個就是在樣品的分離階段和純化階段，如何有效結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)；在微生物的檢測階段，如何實現(xiàn)與LAMP技術(shù)的結(jié)合性運用等。最后就是PCR技術(shù)應(yīng)用范圍的不斷擴大，如何應(yīng)用這項技術(shù)確定肉源性成分，如何依托這項技術(shù)確定豬肉的新鮮度等。