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        一種無(wú)害化檢測(cè)布魯氏桿菌的方法

        2019-08-18 11:50:24楚文慶
        獸醫(yī)導(dǎo)刊 2019年6期
        關(guān)鍵詞:布魯離心管布病

        楚文慶 董 武

        (內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古通遼 025000)

        布病是由布魯氏菌屬細(xì)菌所引起的一種廣泛分布于世界各地的人獸共患傳染。布病的主要傳染源是牛、羊、豬,其中羊的布病對(duì)人的毒力性最強(qiáng),致病力最高,對(duì)人的健康危害性也最大。

        1 材料與儀器

        omp22引物,流產(chǎn)型布魯氏桿菌DNA,水,2×Taq酶,移液槍,八連管;

        ZR DNA Sequencing Clean-up Kit,PCR擴(kuò)增儀,高速臺(tái)式離心機(jī),電泳儀,紫外透射反射分析儀,凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng);Nano Drop超微量分光光度計(jì);甲醛溶液(40%,4%,0.4%),新潔爾滅溶液(30g/L,3g/L,0.3g/L),離心管,純化柱。

        2 方法步驟

        (1)DNA擴(kuò)增:①引物稀釋:分別向omp22上下游引物加入228 μl與286 μL去離子水,振蕩離心;取10 μl稀釋液加入90 μl的水混合震蕩離心。

        ②配制擴(kuò)增體系:加入25 μl的2×Taq酶,引物各2.5 μl,2 μl的DNA,18 μl的水至八連管中,混勻封好。

        ③設(shè)置擴(kuò)增參數(shù):stage1:95℃×1,1min;stage2:95℃(15sec)→60℃(15sec)→72℃(30 sec)共計(jì)35個(gè)循環(huán);stage3:72℃×1(7 min)→4℃保存。

        ④電泳:配制2%的瓊脂糖凝膠電泳(其中加入GV-Ⅱ熒光染料),依次加入mark與DNA樣本,95℃進(jìn)行30 min的電泳。

        ⑤凝膠回收:

        ⑥Ligation:

        成分 體積10×T4DNA Ligation Buffer 1μl T4DNA Ligase(3U/μl) 1μl PGM-T載體(50ng/μl) 1μl目的片段 2μl ddH2O 5μl

        (2)無(wú)害化處理布魯氏桿菌

        ①將測(cè)序結(jié)果可用且濃度為200ng/μl的DNA稀釋到40ng/μl,取出10μl的40ng/μlDNA于已經(jīng)做好標(biāo)記的1.5 ml的離心管(tube)中;

        ②將不同種類不同濃度的消毒劑按照與DNA1:1的比例混合到tube中,使DNA處理時(shí)間分別為10 min,30 min,1 h以及12h;

        ③將處理過(guò)的DNA進(jìn)行純化,把②中的混合液轉(zhuǎn)移到純化柱中,加入240 μlSequencing Binding Buffer,離心12000 rpm,30 s;

        ④加入300 μl的Wash Buffer 12000rpm,30 s;

        ⑤重復(fù)步驟④兩次;

        ⑥加Elution Buffer 20 μl,換一個(gè)新tube,離心12000 r,30 s;

        ⑦電泳:PCR總反應(yīng)為30 μl體系,2×Taq酶10μl,上下游布魯氏菌OMP引物1.5μl,DNA 1.5μl,去離子水15.5μl。95℃作用5 min,進(jìn)入循環(huán),95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,共計(jì)35個(gè)循環(huán),然后72℃延伸7 min,4℃forever。

        2%瓊脂糖凝膠電泳,電壓90V,時(shí)間30 min,凝膠成像系統(tǒng)觀察。

        3 結(jié)果分析

        PFA時(shí)間依存性

        不一樣濃度多聚甲醛處置對(duì)布病DNA產(chǎn)量的影響。使用不同濃度的PFA處理布病DNA,10 min,30 min,1 h以及12h后純化DNA產(chǎn)量PFA溶液不同時(shí)間不同濃度來(lái)處理布魯氏桿菌與對(duì)照組一樣,都在500bp片段左右產(chǎn)生明亮的條帶。不同濃度(1%,2%和4%PFA)處理30min與12h后,與對(duì)照組相比,4%PFA總DNA濃度顯著,但30minPFA處理的DNA總量相比于對(duì)照組有所減少,所以用4%PFA處理布氏桿菌30min即可。

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