閆文超 黃峰

摘 要：用分子層析的方法，對(duì)19株木腐真菌在特定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖后所得的胞外培養(yǎng)液進(jìn)行了分離及漆酶和PO activity 測(cè)定。發(fā)現(xiàn)，胞外具有酚氧化酶活性的小分子物質(zhì)在所有產(chǎn)漆酶的白腐菌中具有普遍性，推測(cè)這種小分子物質(zhì)在木質(zhì)素生物降解過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。

關(guān)鍵詞：白腐菌，漆酶，酚氧化酶活性，小分子物質(zhì)

對(duì)木纖物質(zhì)表面結(jié)構(gòu)研究顯示，目前發(fā)現(xiàn)的主要木質(zhì)素降解酶如木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）、錳過(guò)氧化物酶（MnP）和漆酶（laccase）等酶分子尺寸均大于木纖物質(zhì)表面微孔孔徑，因而難以滲透并與內(nèi)部木質(zhì)素接觸[1-2]。單獨(dú)的大分子酶類(lèi)不能構(gòu)成完整的木質(zhì)素降解系統(tǒng)，必須有一些小分子活性物質(zhì)的參與才能完成對(duì)木質(zhì)素的自然降解過(guò)程。將培養(yǎng)液用膜過(guò)濾以除去菌絲，發(fā)現(xiàn)濾液能使硫酸鹽漿脫除木質(zhì)素[3]，表明真菌與纖維的接觸不是必須的，真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的氧化酶類(lèi)和其它物質(zhì)共同導(dǎo)致了一個(gè)緩慢的、連續(xù)的木質(zhì)素降解過(guò)程。

作者通過(guò)對(duì)一株白腐菌的研究發(fā)現(xiàn)，白腐菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生一種小分子物質(zhì)。這種小分子物質(zhì)，除能產(chǎn)生羥自由基，能絡(luò)合鐵，能還原三價(jià)鐵為二價(jià)鐵外，還具有類(lèi)似于酚氧化酶的活性，推測(cè)這種小分子物質(zhì)在木質(zhì)素降解過(guò)程中起著重要作用[4]。但是這種胞外具有類(lèi)酚氧化酶的活性小分子物質(zhì)在白腐菌中是否具有普遍性，值得深入研究。

一、材料與方法

（一）菌種

本研究采用菌種部份為實(shí)驗(yàn)室自行篩選所得，部份為實(shí)驗(yàn)室原有菌株?；厩闆r如下表所示。

（二）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

適量麩皮及木粉，煮沸30分鐘，過(guò)濾后倒入300mL三角瓶中，接種后放于30℃搖床上培養(yǎng)。

（三）培養(yǎng)液提取及其成分分離

各菌培養(yǎng)一定時(shí)間后，將培養(yǎng)液離心取上清酶液放于0℃冷藏備用。以20mM pH 4.8的HAc-NaAc緩沖液對(duì)各菌酶液進(jìn)行Sephadex G25分子篩層析，對(duì)層析液進(jìn)行分步收集。對(duì)每管收集液進(jìn)行漆酶及PO activity 測(cè)定。

（四）漆酶的測(cè)定

以2，6-DMP（2，6-二甲基酚）為底物，2mL pH值4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，20mmol/L的2，6-DMP 50uL，酶液適量。30℃下檢測(cè)470nm處的吸收變化。消光系數(shù)ε=49600 mol-1Lcm-1 。以每分鐘轉(zhuǎn)化1umol底物定義為一個(gè)酶活單位。

（五）胞外小分子物質(zhì)PO activity檢測(cè)方法

取樣品1mL及10mM 2，6-DMP1mL，測(cè)反應(yīng)混合液在470nm處的吸光值變化。

二、結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，我們發(fā)現(xiàn)，在杏鮑菇、LG9、LG6、Lentinus lepideus、紅柄牛肝菌、BYBF、YDHSD2、Gloeophyllum saepiarium、真姬等這些真菌的Sephadex G25層析液中，都有具有PO活性的小分子物質(zhì)存在。如圖1～所示，各圖中，系列1中的第一個(gè)峰與系列2中的第一個(gè)PO活性峰相對(duì)應(yīng)，即為漆酶峰，系列2中其它幾個(gè)PO活性峰則是小分子物質(zhì)的作用結(jié)果。

三、結(jié)論

以上結(jié)果表明，凡產(chǎn)漆酶的菌，均產(chǎn)具有酚氧化酶的活性小分子物質(zhì)。而不產(chǎn)漆酶的菌，則都不產(chǎn)此種小分子物質(zhì)。說(shuō)明具有酚氧化酶活性的小分子物質(zhì)在產(chǎn)漆酶的白腐中具有一定的普遍性。同時(shí)也可以推測(cè)，這種胞外的小分子物質(zhì)在木質(zhì)素生物降解過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用，值得進(jìn)一步深入研究。

系列1：酶液G-25層析圖譜 ?系列2：氧化DMP活性曲線

系列1：酶液G-25層析圖譜

系列2：氧化DMP活性曲線

系列1：酶液G-25層析圖譜

系列2：氧化DMP活性曲線（不含漆酶峰）

參考文獻(xiàn)

[1] Flournoy， D.S.， Kirk， T.K. and Highley， T.L. Wood decay by brown-rot fungi： changes in pore structure and cell wall volume [J]. Holzforschung， 1991， 45： 383-388.

[2] Flournoy， D.S.， Paul， J.A.， Kirk， T.K. et al.， Changes in the size and volume pores of sweet gum wood during simultaneous rot by Phanerochaete chrysosporium [J]. Holzforschung， 1993， 47： 297-301.

[3] 閆文超，黃峰，高培基等.對(duì)白腐菌胞外小分子物質(zhì)的初步研究[J].中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2003，18（2）：47-50.

基金項(xiàng)目：本項(xiàng)目為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30170027），同時(shí)獲得教育部全國(guó)優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專(zhuān)項(xiàng)資金資助（200023）和華南理工大學(xué)制漿造紙工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助。

作者簡(jiǎn)介：閆文超（1979.06- ），男，漢族，貴州貴陽(yáng)人，碩士研究生，副教授，研究方向：微生物。