束慧

摘 要-葡萄糖醛酸苷酶（GUSB）是一類(lèi)重要的存在于腸道菌群代謝物中的酸性水解酶，可催化分解具有 -葡萄糖醛酸苷結(jié)構(gòu)的底物。腸道菌群產(chǎn)生的GUSB可影響多種藥物的藥代動(dòng)力學(xué)行為，例如，伊立替康等藥物的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物可被腸道菌群產(chǎn)生的GUSB分解成為苷元并在腸道局部累積，可能引發(fā)嚴(yán)重的胃腸不良反應(yīng)。因此，尋找或開(kāi)發(fā)高效抑制腸道菌群產(chǎn)生的GUSB活性的藥物，對(duì)于緩解一些臨床藥物產(chǎn)生的副作用而引發(fā)的嚴(yán)重腹瀉具有重要意義。在本課題中，我們發(fā)現(xiàn)沃替西汀氫溴酸鹽可以高效地抑制GUSB活性。

關(guān)鍵詞 沃替西汀氫溴酸鹽-葡萄糖醛酸苷酶 抑制劑 腸道菌群

中圖分類(lèi)號(hào)：R914文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

近年來(lái)，腸道菌群與多種疾病研究已成研究的熱點(diǎn)。近些年來(lái)一些研究成果表明，腸道菌群與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、藥物的吸收及代謝過(guò)程密切相關(guān)。 -葡萄糖醛酸苷酶（ -glucuronidase，GUSB），編號(hào)EC3.1.1.31，是溶酶體內(nèi)的酸性水解酶，可催化 -D-1，4-葡萄糖醛酸苷糖苷鍵發(fā)生水解，釋放出 -葡萄糖醛酸和相應(yīng)的配基。

人源GUSB的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與大腸埃希菌（E. coli）的GUSB蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)先后被解析出來(lái)。1996年Jain等人首次解析了人源GUSB的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，2010年Wallace等人對(duì)大腸埃希菌的GUSB蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)完成的解析。大腸埃希菌GUSB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由2種不同的亞基組成，每個(gè)亞基含597個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量均約為70 KD;N端由180個(gè)氨基酸殘基組成，C端的折疊由274-603氨基酸殘基夠成;催化活性結(jié)合位點(diǎn)為Glu 413和504，相鄰亞基之間的菌環(huán)結(jié)構(gòu)（bacterial loops）。大腸埃希菌產(chǎn)生的GUSB與人源GUSB的氨基酸序列相似度約為45%，大腸埃希菌GUSB蛋白結(jié)構(gòu)中具有菌環(huán)結(jié)構(gòu)，但是人源GUSB無(wú)此結(jié)構(gòu)。因此，可以根據(jù)大腸埃希菌GUSB中的菌環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出特異性抑制劑。目前常見(jiàn)的GUSB活性檢測(cè)方法主要有以下3種：比色分析法、熒光法和高效液相色譜法。本研究使用比色分析法對(duì)大腸埃希菌 GUSB進(jìn)行活性檢測(cè)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器

沃替西汀氫溴酸鹽（美國(guó)Selleck公司， S8021）; -葡萄糖醛酸酶（美國(guó)Sigma公司，G7646-5KU ） ;4-硝基苯基 -D-葡糖苷酸（美國(guó)Sigma公司，73677-250MG ）;4-硝基苯酚（美國(guó)Sigma公司，1048-5G）;大腸埃希菌（實(shí)驗(yàn)保存）;細(xì)菌用蛋白酶抑制劑復(fù)合物 （生工，C500027-0001）;磷酸鹽緩沖液（pH7.4）;糞便蛋白提取液;超聲破碎儀（賽飛公司，Biosafer 650-92）;水浴鍋（其林貝爾）;酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司，Mlutiskan FC）。

1.2-葡萄糖醛酸苷酶活性分析

1.2.1-葡萄糖醛酸苷酶純酶活性檢測(cè)

將 -葡萄糖醛酸苷酶純酶粉末配制成5U/ul溶液，取33ul加入到1.617 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）中混合均勻，加入到96孔板的33孔中。使用PBS將沃替西汀氫溴酸鹽配制成以下濃度：30，10，3.33，1.11，0.37，0.123，0.041，0.0137，0.0046，0.0015 uM，各取100ul加入到含有 -葡萄糖醛酸苷酶的96孔板中，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔。每孔加入2ul（25mM）反應(yīng)底物4-硝基苯基 -D-葡糖苷酸（PNPG），37℃避光反應(yīng)1小時(shí)。使用1xPBS將4-硝基苯酚（PNP）稀釋成濃度分別為1，5，10，20，40，80，100和200uM的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取100ul上述標(biāo)準(zhǔn)液，各加入150ul 0.2M Na2CO3，混勻1min，405nm測(cè)定其吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式，依次計(jì)算出對(duì)硝基酚法所測(cè)得的每毫升反應(yīng)液中所含對(duì)硝基酚的含有量。

1.2.2大腸埃希菌中 -葡萄糖醛酸苷酶純酶活性檢測(cè)

將1ul大腸埃希菌菌液使用9ul滅菌的PBS稀釋后，涂布于無(wú)抗性LB固體培養(yǎng)基，倒置在37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取2個(gè)克隆分別加入含有5ml LB液體培養(yǎng)基的50ml離心管中，置于37℃搖床，200rpm孵育過(guò)夜。4000rpm離心5min，棄LB液體培養(yǎng)基，加入10ml預(yù)冷的PBS洗滌兩次，離心棄PBS，再次加入2ml預(yù)冷的PBS（含20ul 細(xì)菌用蛋白酶抑制劑復(fù)合物），超聲破碎至液體變澄清，12000rpm離心30min，取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒，檢測(cè)蛋白濃度。取3ul（1.61ug/ul）裂解產(chǎn)物檢測(cè)其中 -葡萄糖醛酸苷酶的活性，加入不同濃度的沃替西汀氫溴酸鹽。沃替西汀氫溴酸鹽濃度及相關(guān)步驟參照1.3.1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Prism 5.0 （GraphPad Software）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù) ？標(biāo)準(zhǔn)差 （ x ？s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1?-葡萄糖醛酸苷酶純酶活性檢測(cè)

以對(duì)硝基苯酚（P-nitrophenol，PNP）作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出 y = 0.0042x + 0.0612，R2 = 0.9964（圖1-A）。根據(jù)所得到的OD值，計(jì)算出IC50=0.2212 uM（圖1-B）。高濃度沃替西汀氫溴酸鹽組的 -葡萄糖醛酸苷酶純酶活性，相比于PBS組下降明顯;低濃度沃替西汀氫溴酸鹽組的 -葡萄糖醛酸苷酶純酶活性，相比于PBS組沒(méi)有顯著性差異（圖1-C）。

圖1（A）PNP作為標(biāo)準(zhǔn)品得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，y = 0.0042x + 0.0612，R2 = 0.9964;（B）100ul不同濃度沃替西汀氫溴酸鹽與5U GUSB及2ul（25mM）PNPG反應(yīng)，計(jì)算得到IC50=0.2212 uM;（C）100ul不同濃度沃替西汀氫溴酸鹽與2ul（25mM）PNPG反應(yīng)所得OD值的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，0.0137，0.0046和0.0015 uM組分別與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，30，10，3.33，1.11，0.37，0.123和0.041uM組分別與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.001。

2.2沃替西汀氫溴酸鹽對(duì)E. coli中 -葡萄糖醛酸苷酶活性的影響

以對(duì)硝基苯酚（P-nitrophenol，PNP）作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出 y = 0.0043x + 0.0698，R2 = 0.9937（圖2-A）。根據(jù)所得到的OD值，計(jì)算出IC50=0.9043 uM（圖2-B）。高濃度沃替西汀氫溴酸鹽組的E. coli中 -葡萄糖醛酸苷酶活性，相比于PBS組下降明顯，有顯著性差異（ P<0. 01）;低濃度沃替西汀氫溴酸鹽組的E. coli中 -葡萄糖醛酸苷酶活性，相比于PBS組沒(méi)有顯著性差異（圖2-C）。

圖2（A）PNP作為標(biāo)準(zhǔn)品得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，y = 0.0043x + 0.0698，R2 = 0.9937;（B）100ul不同濃度沃替西汀氫溴酸鹽與3ul（1.61ug/ul）E. coli裂解產(chǎn)物及2ul（25mM）PNPG反應(yīng)，計(jì)算得到IC50=0.9043 uM;（C）100ul不同濃度沃替西汀氫溴酸鹽與3ul（1.61ug/ul）E. coli裂解產(chǎn)物及2ul（25mM）PNPG反應(yīng)所得OD值的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，1.11，0.37，0.123，0.041，0.0137，0.0046和0.0015 uM組分別與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，30，10，3.33和1.11uM組分別與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.001。

3討論

腸道菌群和多種疾病的產(chǎn)生有著密切的相關(guān)性，已成為多種疾病治療靶點(diǎn)。腸道菌群產(chǎn)生的GUSB可催化諸多藥物發(fā)生水解，釋放的苷元會(huì)引起嚴(yán)重的遲發(fā)型腹瀉，沃替西汀氫溴酸鹽通過(guò)抑制GUSB活性，減少相關(guān)藥物的葡萄糖醛酸苷產(chǎn)物發(fā)生水解，確保腸道菌群的種類(lèi)及數(shù)量的平行，達(dá)到治療遲發(fā)型腹瀉的效果。近年來(lái)，隨著對(duì)藥物研究的不斷深入，新藥的開(kāi)發(fā)成本太高、周期太長(zhǎng)，新藥老用已成為研究的熱點(diǎn)。我們還可以從一線臨床用藥、中草、食品或土壤成分尋找腸道菌群中GUSB的特異性抑制劑，結(jié)合高效安全的生物學(xué)和化學(xué)衍生技術(shù)獲得更加安全高效的腸道菌群中GUSB活性抑制劑。

參考文獻(xiàn)

[1] 林璋，祖先鵬，謝海勝.腸道菌群與人體疾病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2016， 51（06）： 843-852.

[2] Yano，J.M.&K.Yu&G.P.Donaldson，etal.Indigenous bacteria from the gut microbiota regulate host serotonin biosynthesis[J].Cell，2015，161（02）：264-76.

[3] Shen，Y.&J.Xu&Z.Li，etal.Analysis of gut microbiota diversity and auxiliary diagnosis as a biomarker in patients with schizophrenia：A cross-sectional study[J].Schizophr Res，2018（197）：470-477.

[4] Strandwitz，P.&K.H.Kim&D.Terekhova，etal.GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota[J].Nat Microbiol，2019，4（03）：396-403.

[5] Kim，S.&S.H.Kwon&T.I.Kam，etal.Transneuronal Propagation of Pathologic-Synuclein from the Gut to the Brain Models Parkinson's Disease[J].Neuron，2019，103（04）：627-641.

[6] Wallace，B.D&H.Wang&K.T.Lane，etal.Alleviating cancer drug toxicity by inhibiting a bacterial enzyme[J].Science，2010，330（6005）： 831-835.

[7] Wallace，B.D.&M.R.Redinbo.The human microbiome is a source of therapeutic drug targets[J]. Curr Opin Chem Biol，2013，17（03）：379-384.

[8] Routy，B&E.Le Chatelier&L.Derosa，etal.Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors[J].Science，2018， 359（6371）：91-97.

[9] Jain，S&W.B.Drendel&Z.W.Chen，etal. Structure? of? human? beta-glucuronidase? reveals? candidate? lysosomal? targeting? and? active-site motifs[J]. Nat Struct Biol， 1996，3（04）： 375-381.

[10] Wallace，B.D&A.B.Roberts&R.M.Pollet，etal.Structure and inhibition of microbiome? beta-glucuronidases? essential? to? the? alleviation? of? cancer drug toxicity[J].Chem Biol， 2015，22（09）：1238-1249.

[11]? 翁仔淼，呂珊珊，侯潔.腸道菌 -葡萄糖醛酸苷酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展，2018，43（03）：177-186.

[12]? Brot，F(xiàn).E.&C.E.Bell&W.S.Sly.Purification and properties of-glucuronidase from human placenta[J]. Biochemistry，1978，17（03）： 385-391.

[13]? Ahmad，S.&M.A.Hughes&K.T.Lane，et al.A high throughput assay for dscovery? of bacterial-glucuronidase inhibitors[J].Curr Chem Genomics，2011（05）：13-20.

[14]? Narita，M.&E.Nagai&H.Hagiwara，etal.Inhibition of beta-glucuronidase by natural glucuronides of Kampo medicines using glucuronide of SN-38 as a substrate[J].Xenobiotica，1993， 23（01）： 5-10.