顏廷進(jìn) 蒲艷艷 張文蘭 田茜 王棟 李群 戴雙 丁漢鳳

摘要：為了探索SNP標(biāo)記技術(shù)在菜豆真實(shí)性和品種純度鑒定中的應(yīng)用，采用2b-RAD技術(shù)對(duì)200份國(guó)內(nèi)外菜豆品種進(jìn)行全基因組掃描、分析和評(píng)價(jià)，從中篩選出3 302個(gè)高分辨率、單拷貝和分布比較均勻的SNP標(biāo)記，可以將除2個(gè)近等基因材料以外的198份品種資源區(qū)分開(kāi)?；诮M合最優(yōu)化算法，利用 Haploview 4.2軟件獲得了菜豆資源鑒定最少SNP位點(diǎn)組合一套，包含46個(gè) Tag- SNP標(biāo)記，與3 302個(gè)SNP標(biāo)記區(qū)分結(jié)果相同。本研究可為菜豆真實(shí)性和品種純度鑒定技術(shù)體系的建立和指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菜豆;SNP標(biāo)記;品種真實(shí)性;品種純度;鑒定

中圖分類號(hào)：S643.1?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A?文章編號(hào)：1001-4942（2019）12-0111-09

Abstract?In order to explore single nucleotide polymorphism （SNP） markers applying in authenticity and purity identification of common bean varieties， two hundred common bean varieties and landraces from China and abroad were conducted genome-wide scanning， analysed and evaluated by 2b-RAD technology. Three thousand three hundred and two SNP markers were screened out with high resolution， single copy and uniform distribution in the linkage map， which could distinguish all the varieties and landraces except two near-isogenic materials. Based on the combinatorial optimization algorithm， 46 Tag-SNP markers as the minimum site combination of SNPs were obtained by Haploview 4.2 software，Whose distinguishing ability was as same as that of the 3 302 SNP markers. The study provided a foundation for the identification of variety genuineness and purity and the construction of fingerprint database of common bean.

Keywords?Common bean; SNP markers; Variety genuineness; Variety purity; Identification

菜豆（Phaseolus vulgaris L.）作為世界范圍內(nèi)重要的食用豆類作物，擁有最大的豆類種植面積[1]，產(chǎn)量約占全球食用豆的一半[2]。它起源于中美洲和安第斯山兩個(gè)中心[3]，并于500多年前引入中國(guó)進(jìn)行栽培[4]。我國(guó)菜豆品種資源較為豐富[5]，是世界上普通菜豆生產(chǎn)和消費(fèi)的主產(chǎn)區(qū)之一。作為我國(guó)重要的植物蛋白質(zhì)來(lái)源，菜豆在貧困地區(qū)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和人類繁衍發(fā)展方面發(fā)揮了重要作用，同時(shí)也為發(fā)達(dá)地區(qū)膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整做出巨大貢獻(xiàn)[6]。

農(nóng)作物品種真實(shí)性鑒定和純度分析是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展過(guò)程中的重要技術(shù)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著作物生物學(xué)研究的發(fā)展，菜豆品種的真實(shí)性和純度技術(shù)分析經(jīng)歷了多個(gè)階段。形態(tài)學(xué)方法主要是田間小區(qū)種植鑒定，依靠品種間的特征特性差異進(jìn)行品種區(qū)分，是評(píng)價(jià)作物真實(shí)性、純度鑒定和遺傳多樣性的有效手段之一[7-9]。較多研究證實(shí)利用形態(tài)標(biāo)記對(duì)普通菜豆品種進(jìn)行真實(shí)性鑒定、結(jié)構(gòu)分析和多樣性研究非常有效，有助于進(jìn)一步了解品種形態(tài)變異特點(diǎn)及亞群之間的關(guān)系[10-13]，但易受人為因素、環(huán)境氣候條件的影響，無(wú)法保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及時(shí)效性。

隨著分子群體遺傳學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，朊蛋白、同工酶等被用于作物品種結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究。其中朊蛋白標(biāo)記方法在普通菜豆遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性研究中應(yīng)用最廣泛[14-17]。蛋白質(zhì)和同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其遺傳方式并非全部表現(xiàn)為共顯性遺傳，多態(tài)性較少，對(duì)親緣關(guān)系較近及遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜的材料難以鑒別。近年來(lái)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)由于具有豐富的多態(tài)性和顯著的個(gè)體特異性，能夠在分子水平上識(shí)別品種間差異，不易受外界環(huán)境影響，可快速、準(zhǔn)確地完成品種鑒定[18-20]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、品種鑒定和純度分析、基因定位、圖位克隆等多項(xiàng)研究中[21-24]，同樣應(yīng)用于玉米、小麥、甘藍(lán)、大豆、水稻、棉花、馬鈴薯等作物的鑒定工作[25-31]。但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，SSR標(biāo)記出現(xiàn)了不易實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)整合和通量低等缺陷。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）標(biāo)記作為最新發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記，具有檢測(cè)通量大、分布密度廣、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、速度快等特點(diǎn)，并且國(guó)內(nèi)外很多公司推出的各種SNP分析檢測(cè)平臺(tái)，其分析系統(tǒng)自動(dòng)化程度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化操作，很好地彌補(bǔ)了SSR標(biāo)記的技術(shù)缺陷，適合大規(guī)模SNP研究及基因分型。迄今，SNP標(biāo)記技術(shù)已在水稻[32]、玉米[33，34]、大豆[35]、大麥[36]、棉花[37]等作物品種鑒定研究中得到廣泛應(yīng)用。

本研究將SNP標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于200份普通菜豆的品種鑒定，利用抽提得到的DNA，采用2b-RAD技術(shù)，使用標(biāo)準(zhǔn)型5′-NNN-3′接頭與酶切標(biāo)簽連接，于文庫(kù)質(zhì)控合格后在Illumina Hiseq Xten平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序，以期篩選出鑒定不同菜豆品種資源的最少SNP位點(diǎn)組合，并為菜豆品種測(cè)序真實(shí)性和純度鑒定技術(shù)體系的建立和指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

供試樣品為200份菜豆品種（表1）。其中，152份材料引自美國(guó)西部植物引種站（Western Regional Plant Introduction Station），來(lái)源于墨西哥、哥倫比亞、秘魯、危地馬拉、玻利維亞等10個(gè)國(guó)家;48份為從國(guó)家資源庫(kù)引進(jìn)的國(guó)內(nèi)品種，材料類型分為地方品種和栽培品種。

1.2?DNA提取和2b-RAD測(cè)序

采用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品]抽提菜豆基因組DNA，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書，并通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和Thermo Scientific NanoDrop ND-2000進(jìn)行DNA質(zhì)量和濃度檢測(cè)。

2b-RAD是一種簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，其原理是使用ⅡB型限制性核酸內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行酶切，然后對(duì)酶切片段進(jìn)行測(cè)序。本試驗(yàn)所提DNA經(jīng)檢測(cè)后利用該技術(shù)進(jìn)行酶切，酶切后的簡(jiǎn)化基因組測(cè)定由青島歐易生物科技有限公司Illumina Hiseq Xten平臺(tái)完成。

1.3?測(cè)序質(zhì)量分析和SNP基因分型

利用Illumina Hiseq Xten平臺(tái)對(duì)2b-RAD技術(shù)構(gòu)建的200個(gè)菜豆樣品標(biāo)簽測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行雙端（paired-end）測(cè)序，采用標(biāo)準(zhǔn)型5′-NNN-3′接頭建庫(kù)。將原始reads（測(cè)序時(shí)的最小序列單位）按照以下條件進(jìn)行過(guò)濾：（1）剔除不含有限制性內(nèi)切酶（BsaXⅠ）識(shí)別位點(diǎn)的序列;（2）剔除低質(zhì)量序列（質(zhì)量值低于30的堿基超過(guò)15%，判定為低質(zhì)量reads）;（3）剔除含N堿基的序列。將得到的高質(zhì)量reads用于后續(xù)分析。

對(duì)于有參考基因組的標(biāo)記，采用RAD typing軟件，利用最大似然法進(jìn)行分型。為了保證SNP位點(diǎn)分型的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性，進(jìn)行以下條件的過(guò)濾：（1）剔除最小的等位基因頻率（MAF）小于0.01的SNP位點(diǎn);（2）剔除SNP分型缺失率高于20%的位點(diǎn);（3）剔除同一個(gè)標(biāo)簽上SNP位點(diǎn)多于2個(gè)的數(shù)據(jù)。

1.4?數(shù)據(jù)分析

使用Haploview 4.2軟件進(jìn)行SNP標(biāo)簽統(tǒng)計(jì)分析，從而獲得鑒定菜豆所用的最少SNP位點(diǎn)組合，即核心SNP位點(diǎn);通過(guò)TreeBeST 1.9.2軟件計(jì)算距離矩陣，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?SNP位點(diǎn)分布

參照Fu[38]等的基因分型策略，以菜豆為參考基因組（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/499/845/GCF_000499845.1_PhaVulg1_0/GCF_000499845.1_PhaVulg1_0_genomic.fna.gz），根據(jù)比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)樣品獲得的標(biāo)簽數(shù)及深度信息并計(jì)算測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)參考基因組的覆蓋度。200個(gè)樣品的標(biāo)簽平均數(shù)目為83 497，平均測(cè)序深度為29×，覆蓋度范圍0.38%～0.49%;獲得25 561個(gè)SNP位點(diǎn)，使用劃窗口的方式繪制SNP在染色體上的分布圖，窗口大小設(shè)置為200 kbp，每次移動(dòng)100 kbp，統(tǒng)計(jì)區(qū)間內(nèi)的SNP數(shù)目，結(jié)果如圖1所示。SNP在菜豆染色體上的平均分布密度為每kb 4.92×10-2個(gè)。

2.2?核心SNP位點(diǎn)篩選

從獲得的25 561個(gè)SNP位點(diǎn)中刪除有缺失的SNP，剩余3 302個(gè)SNP位點(diǎn)，再用 Haploview 4.2軟件挑選 tag SNP，篩選條件： MAF=0.2，哈迪溫伯格平衡 p-value>10-7。試驗(yàn)共篩選得到19個(gè)位點(diǎn)，將這19個(gè)位點(diǎn)連接成序列，得到146條序列。其中有四條序列分別對(duì)應(yīng)16、17、5、3個(gè)菜豆樣品。用 Haploview 軟件繼續(xù)挑選16個(gè)樣品中的tag SNP，結(jié)合人工篩選，挑選出10個(gè)位點(diǎn)，可以將該類樣品分開(kāi)。利用同樣的方法挑選tag SNP區(qū)分包含17、5、3個(gè)等個(gè)數(shù)的樣品，共挑選出17個(gè)位點(diǎn)。綜合分析可得，使用46個(gè)位點(diǎn)可以將198個(gè)品種樣品區(qū)分開(kāi)來(lái)（表2）。

2.3?品種鑒別方法

將每個(gè)樣品的3 302個(gè)沒(méi)有缺失的位點(diǎn)連接成序列后，得到199條不同序列，可以很容易區(qū)分198個(gè)菜豆品種。為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化操作程序，節(jié)約試驗(yàn)成本，通過(guò)軟件分析結(jié)合人工挑選，篩選出46個(gè)核心位點(diǎn)。將每個(gè)品種的46個(gè)核心位點(diǎn)按染色體排列順序從左到右、從上到下連接成序列，也獲得了不同的199條序列（表3）。利用每個(gè)品種之間的位點(diǎn)差異、排列順序的不同，同樣可達(dá)到區(qū)分198個(gè)菜豆品種的目的。由于P-190 和 P-200 兩個(gè)樣品親緣關(guān)系較近，不能用此進(jìn)行區(qū)分，因而必須使用有缺失的SNP位點(diǎn)（NC_023749.1-7722596位點(diǎn)）。本試驗(yàn)共通過(guò)47個(gè)SNP位點(diǎn)完成了200個(gè)菜豆品種的區(qū)分工作。

2.4?系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

將每個(gè)SNP標(biāo)記首尾相連，如果缺失相應(yīng)的位點(diǎn)，則用“-”代替。獲得的序列采用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，利用TreeBesT 1.9.2軟件計(jì)算距離矩陣，進(jìn)化樹(shù)的可靠性通過(guò)bootstrap 法進(jìn)行檢驗(yàn)（重復(fù)1 000次）。由圖2可以很清晰地看到，本試驗(yàn)建立的SNP標(biāo)記法可以將200份菜豆品種按照親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近分類，從而進(jìn)一步探明了200份菜豆的進(jìn)化歷程和親緣關(guān)系。

3?討論與結(jié)論

快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)技術(shù)是研究工作者的追求目標(biāo)。宋偉等[39]利用42個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)信息成功區(qū)分105份玉米自交系材料;劉麗華等[40]研究表明14個(gè)SNP標(biāo)記與384個(gè)SNP標(biāo)記區(qū)分能力相同，可區(qū)分378個(gè)小麥材料中的376個(gè)，僅有兩個(gè)近等位基因系的品種無(wú)法區(qū)分，區(qū)分開(kāi)的比例為99.5%。本研究利用46個(gè)SNP位點(diǎn)成功對(duì)198個(gè)菜豆品種進(jìn)行區(qū)分，區(qū)分開(kāi)的比例為99%，對(duì)于親緣關(guān)系特別近的兩個(gè)樣品P1-199和P-200采用SNP缺失的辦法進(jìn)行了區(qū)分。但隨著菜豆新品種數(shù)量的增加，已篩選出的核心SNP位點(diǎn)能否滿足要求，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，并且還可能需要再確定新的核心位點(diǎn)。但對(duì)于親緣關(guān)系特別近的品種，即使再增加核心位點(diǎn)也無(wú)法進(jìn)行區(qū)分，建議使用“核心位點(diǎn)+擴(kuò)展位點(diǎn)”相結(jié)合的模式，達(dá)到完全區(qū)分所有品種的目的。

目前，Cavanagh等[41]和Wang等[42]分別開(kāi)發(fā)了小麥9k和90k高通量SNP分析芯片，用于小麥身份鑒定。以后的應(yīng)用研究中，我們應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證菜豆46個(gè)核心SNP位點(diǎn)的有效性，若能成功區(qū)分所有菜豆品種，可以考慮將46個(gè)SNP位點(diǎn)連成序列，做成芯片，進(jìn)而構(gòu)建菜豆品種真實(shí)性和品種鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)，直接用于菜豆品種真實(shí)性和品種純度鑒定。

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