王曉霞，邵增瑯，唐杏燕，裴少芬，黃鳴，黃葉飛

（南京融點(diǎn)食品科技有限公司速溶茶工程研究中心，江蘇南京 211300）

植物內(nèi)生真菌（Endophytic Fungi）是指生活在植物寄主中并度過(guò)全部或近乎全部生活周期，而對(duì)寄主植物并不引起明顯病害的真菌[1]。近年來(lái)，內(nèi)生真菌由于物種豐富，數(shù)量龐大，且與其它生物之間生態(tài)關(guān)系緊密，成為天然活性物質(zhì)的潛在來(lái)源，引起國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[2]。相對(duì)于其它植物內(nèi)生真菌，茶樹(shù)內(nèi)生真菌的研究起步相對(duì)較晚，一般集中于不同茶樹(shù)、不同部位菌種的分離差異和內(nèi)生真菌抗菌活性的篩選，未見(jiàn)將功能性茶樹(shù)內(nèi)生真菌應(yīng)用于速溶茶生產(chǎn)的報(bào)道。茶樹(shù)中含有茶多酚、咖啡堿和茶氨酸等多種次生代謝產(chǎn)物，基于內(nèi)生真菌能夠和寄主植物互作的原理，有可能發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化這些活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌菌株。

多酚氧化酶是茶樹(shù)中普遍存在的一種酶，是紅茶加工中品質(zhì)形成的關(guān)鍵酶類，可催化氧化兒茶素類物質(zhì)形成茶黃素、茶紅素類色素，對(duì)紅茶色、香、味等品質(zhì)的形成具有關(guān)鍵作用[3]。多酚氧化酶在速溶紅茶加工中的重要作用受到廣泛關(guān)注和研究。

近些年，隨著冰紅茶飲料的迅猛發(fā)展，大大增加了速溶紅茶的需求量。由于常規(guī)速溶紅茶生產(chǎn)必須以紅茶作為提取原料，而當(dāng)前紅茶原料供需矛盾突出，但低檔綠茶和烏龍茶原料供應(yīng)充分，于是很多速溶茶生產(chǎn)企業(yè)以綠茶或?yàn)觚埐铻樵?，通過(guò)堿轉(zhuǎn)溶法制備速溶紅茶，但是堿轉(zhuǎn)溶速溶紅茶存在茶湯湯色深暗、轉(zhuǎn)溶氣味濃、口感單薄等問(wèn)題，用在冰茶中勉強(qiáng)可用，在奶茶類產(chǎn)品中則無(wú)法滿足優(yōu)質(zhì)奶茶湯色粉紅或黃紅明亮、口感濃醇爽滑的品質(zhì)要求[4]。研究就目前速溶茶生產(chǎn)中存在的堿轉(zhuǎn)溶速溶紅茶品質(zhì)差等問(wèn)題，從茶樹(shù)內(nèi)生真菌中篩選出產(chǎn)多酚氧化酶的內(nèi)生真菌菌株，并將其應(yīng)用于速溶茶的生產(chǎn)工藝中，初步探討產(chǎn)多酚氧化酶內(nèi)生真菌在速溶茶生產(chǎn)中的應(yīng)用效果和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的可能性，為功能性茶樹(shù)內(nèi)生真菌的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

提取用的綠碎茶原料購(gòu)自黃山一品有機(jī)茶葉有限公司；內(nèi)生真菌菌株篩選自江蘇省南京市紫金山中山陵茶廠中種植了十年的 “龍井長(zhǎng)葉”茶樹(shù)。

茶多酚購(gòu)自大閩食品（漳州）有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱 （太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DHG-9003BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；TU-1810DS紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SW-CJ-ID型雙人凈化工作臺(tái) （蘇州凈化設(shè)備有限公司）；2100N臺(tái)式濁度儀（哈希公司）；Lovibond PFX195比色計(jì) （深圳鼎鴻運(yùn)貿(mào)易科技發(fā)展有限公司）；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì) （上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SPD-1SC高效液相色譜儀（島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20.0 g煮沸30 min，葡萄糖2.0 g，瓊脂1.7 g，蒸餾水100 mL；121℃滅菌20 min。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g煮沸30 min，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1000 mL；121℃滅菌20 min。

茶多酚液體培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基中添加茶多酚0.4 g/L。

茶多酚固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中添加茶多酚0.4 g/L。

茶水發(fā)酵培養(yǎng)基：綠碎茶100.0 g，水1300 mL，93℃浸提 30 min，紗布過(guò)濾去除茶渣；121℃滅菌 20 min。

1.3.2 內(nèi)生菌的篩選

參考陳煙蘭等[5]的方法，在茶園中隨機(jī)采集直徑為0.5 mm以上的健康茶樹(shù)枝條。將采回的樣本葉片摘下，用75%酒精浸泡30 s，再用無(wú)菌水漂洗，自然晾干后用于內(nèi)生真菌的分離、培養(yǎng)。從每一葉片中用無(wú)菌解剖刀在距葉柄約1/3處沿主脈切開(kāi)，切取約0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，經(jīng)表面消毒后，在裝有50 mL茶多酚液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28℃、180 r/min條件下富集培養(yǎng)耐茶多酚的茶樹(shù)內(nèi)生真菌，每一個(gè)三角瓶各放入茶葉組織塊5個(gè)。培養(yǎng)一定時(shí)間后將茶葉組織塊上出現(xiàn)的真菌菌絲分別移接到PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行純化、編號(hào)保存。菌種用甘油管低溫保藏。

1.3.3 內(nèi)生菌在速溶紅茶生產(chǎn)中的應(yīng)用

將篩選出的產(chǎn)多酚氧化酶較強(qiáng)菌株制成菌懸液，以相同接種量單獨(dú)或混合接種到茶多酚液體培養(yǎng)基中，測(cè)定菌株生長(zhǎng)情況；將生長(zhǎng)旺盛的菌株接種到茶水發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)4 d，每隔1 d取發(fā)酵液，將發(fā)酵液用8層紗布過(guò)濾、濃縮、滅菌、噴干后觀察湯色、測(cè)定色度、茶多酚含量及其它相關(guān)指標(biāo)。

1.3.4 測(cè)定方法

生長(zhǎng)曲線測(cè)定。菌體生長(zhǎng)量使用分光光度法測(cè)定[6]，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光值，用OD600表示，圖表中OD600值均為菌體發(fā)酵液吸光值減去不接菌培養(yǎng)基吸光值。

茶粉湯色變化。對(duì)茶粉湯色變化進(jìn)行拍照，并用色度儀測(cè)定色度值L*、a*、b*值的變化。

理化指標(biāo)測(cè)定。噴干茶粉中茶多酚含量采用GB/T 8313—2018[7]中的HPLC法測(cè)定，咖啡堿采用GB/T 8312—2013[8]中的紫外分光光度法測(cè)定；pH和濁度分別采用數(shù)顯pH計(jì)和臺(tái)式濁度儀測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理，通過(guò)ANOVA方式，采用Duncan’s multiple range tests對(duì)不同處理之間的差異性在p＜0.05及p＜0.01水平上進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)多酚氧化酶菌株的篩選

通過(guò)PDA培養(yǎng)基初篩和茶多酚固體培養(yǎng)基復(fù)篩，從茶樹(shù)葉片組織中分離得到了5株能在茶多酚培養(yǎng)基中較強(qiáng)較快產(chǎn)生紅褐色氧化圈的菌株， 分別命名為 EC-1、EC-2、EC-3、EC-4 和 EC-5，如圖 1。

將這5株菌轉(zhuǎn)接到茶多酚液體培養(yǎng)基中，測(cè)定其生產(chǎn)情況。從圖2（A）可以看出，這5株菌均能較好地在茶多酚液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，它們?cè)诓瓒喾右后w培養(yǎng)基中的延滯期均較短，其中EC-1發(fā)酵培養(yǎng)3天后開(kāi)始進(jìn)入衰亡期，其生長(zhǎng)量也較其它菌株少，EC-2和EC-5生長(zhǎng)量接近，EC-5略低。菌株EC-4在茶多酚培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好，其發(fā)酵液變色也最明顯，說(shuō)明其產(chǎn)多酚氧化酶的能力最強(qiáng)[9]，EC-3生長(zhǎng)也很好。

將在茶多酚液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好的兩株菌EC-3和EC-4分別單獨(dú)和1∶1混合轉(zhuǎn)接到新的茶多酚液體培養(yǎng)基中，測(cè)定其生長(zhǎng)情況。從圖2（B）可知，EC-3和EC-4在茶多酚培養(yǎng)基中的延滯期非常短，說(shuō)明這兩株菌已經(jīng)完全適應(yīng)了茶多酚培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，其中EC-3較EC-4早進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，也早進(jìn)入衰亡期，EC-4比EC-3生長(zhǎng)地更好；而EC-3和EC-4混合發(fā)酵，其生長(zhǎng)要比兩者單獨(dú)發(fā)酵更好，可能是混合培養(yǎng)時(shí)兩菌之間發(fā)生直接或間接的相互作用，互相提供所需的營(yíng)養(yǎng)，轉(zhuǎn)移或消除抑制產(chǎn)物，或通過(guò)一些物理或生化機(jī)制刺激彼此間的生理活性[10]。因此，選擇EC-3和EC-4混合菌發(fā)酵綠茶浸提液制備速溶紅茶更適宜。

2.2 EC-3和EC-4混合發(fā)酵綠茶提取液制備速溶紅茶

用 EC-3 和 EC-4 混合菌懸液（1∶1）按 6%接種量混合發(fā)酵綠茶提取液制備速溶紅茶，技術(shù)路線如圖3所示。噴干后茶粉湯色變化如圖4所示，理化指標(biāo)如表1所示。從圖4可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，茶水湯色越來(lái)越接近紅茶特有的品質(zhì)，在發(fā)酵第3 d的時(shí)候，茶水湯色紅艷明亮，金圈厚亮，香氣清爽純正、濃郁持久，滋味醇厚，具有紅茶特有的風(fēng)味。說(shuō)明EC-3和EC-4混合菌能夠很好地利用綠茶提取液進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生多酚氧化酶，將茶水中的兒茶素類物質(zhì)氧化成茶黃素、茶紅素和其他氧化聚合物[11]。另外，氧化3 d的茶湯金圈飽滿厚亮，說(shuō)明紅茶特征性指標(biāo)茶黃素[4]含量較高；發(fā)酵第4 d的湯色紅艷，金圈減少，說(shuō)明此時(shí)茶湯中茶紅素含量過(guò)高，氧化過(guò)度，故用EC-3和EC-4混合發(fā)酵3 d最為適宜。

從表1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，茶湯中茶多酚、咖啡堿以及色度值中的L*、a*值變化顯著（p＜0.01），茶多酚含量明顯減少，咖啡堿含量也逐漸減少；色度值中L*逐漸增大，說(shuō)明混合菌還具有澄清茶湯的作用，可能是混合菌發(fā)酵不僅會(huì)產(chǎn)生多酚氧化酶，還會(huì)產(chǎn)生少量的其它酶類，比如產(chǎn)生單寧酶，使茶湯逐漸變得透亮；a*和b*值逐漸增大，說(shuō)明茶湯逐漸變紅變黃，這和感官看到的湯色變化一致。茶湯的濁度也逐漸減少，這和L*變化應(yīng)該是一樣的原因；發(fā)酵過(guò)程中茶湯的pH逐漸增大，根據(jù)微生物的生長(zhǎng)特點(diǎn)，一般發(fā)酵液的pH應(yīng)該是先降低后升高[12]，而試驗(yàn)中發(fā)酵液pH逐漸增大，這可能跟測(cè)定時(shí)間有關(guān)，從上面的試驗(yàn)結(jié)果可以知道，菌株EC-3和EC-4延滯期較短，當(dāng)發(fā)酵液中的碳源利用完后，菌體相對(duì)較多地利用氮源，導(dǎo)致發(fā)酵液pH值上升[13]。

圖1 株菌在茶多酚固體培養(yǎng)基上的顏色反應(yīng)Fig.1 The color reaction of fungi on the tea polyphenols solid medium

圖2 株菌在茶多酚液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth curve of the fungi on the tea polyphenols liquid medium

圖3 內(nèi)生菌制備速溶紅茶的技術(shù)路線Fig.3 Technical roadmap for preparation of instant black tea by endophytic fungi

圖4 速溶紅茶粉湯色隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.4 Change of the liquor color of instant black tea with fermentation time

表1 速溶紅茶粉理化指標(biāo)隨發(fā)酵時(shí)間的變化Table 1 Change of chemical compontents of instant black tea powder with fermentation time

3 討論

近年來(lái)，對(duì)茶樹(shù)內(nèi)生真菌的研究得到了快速發(fā)展，但在研究程度上存在“初步研究多，深入研究和應(yīng)用少”的特點(diǎn)[14]，研究的質(zhì)量、應(yīng)用面、實(shí)用性提升的空間依然很大。茶葉中含有多種天然活性物質(zhì)，是生物轉(zhuǎn)化先導(dǎo)化合物的資源寶庫(kù)[14]，目前研究較多的依然是茶多酚的生物轉(zhuǎn)化，其他成分的生物轉(zhuǎn)化研究較少，后續(xù)有必要進(jìn)一步擴(kuò)大研究面，為茶樹(shù)功能性成分的開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

文章通過(guò)在茶多酚培養(yǎng)基中顯色的方法[15]，從茶樹(shù)葉片組織中分離得到了5株產(chǎn)多酚氧化酶的菌株，說(shuō)明這些真菌可以利用茶多酚作為營(yíng)養(yǎng)而生長(zhǎng)。這些產(chǎn)多酚氧化酶的菌株中，以EC-3和EC-4混合發(fā)酵效果最好，說(shuō)明其分泌酶的能力最高；通過(guò)EC-3和EC-4混合發(fā)酵綠茶提取液制備速溶紅茶的效果可知，從茶樹(shù)中分離得到的產(chǎn)多酚氧化酶的菌株能實(shí)現(xiàn)綠茶提取液氧化制備速溶紅茶，且氧化效果可觀，這一研究結(jié)論對(duì)茶葉深加工行業(yè)是一大突破，同時(shí)也為茶葉深加工產(chǎn)品提供了新的開(kāi)發(fā)方向。研究雖通過(guò)鑒別培養(yǎng)基平板篩選的方法獲得了目標(biāo)菌株，將其應(yīng)用于速溶茶的生產(chǎn)得到了理想的效果，但并未對(duì)篩選的菌株作生物學(xué)鑒定，還需進(jìn)行后續(xù)工作。另外，考慮到微生物酶系成分復(fù)雜，種類多[16]，因此對(duì)產(chǎn)生的氧化酶的性質(zhì)還有待進(jìn)一步的酶學(xué)分析[17]。