廖忠　陳宇南

【摘要】 胎兒和新生兒溶血性疾?。℉DFN）基本原因是指某些婦女在懷孕期間暴露于父系衍生的紅細(xì)胞抗原或在其既往輸血史中暴露于非自體抗原， 紅細(xì)胞致敏。一旦被致敏， 未來懷孕可能導(dǎo)致HDFN。近幾十年來， HEAs檢測(cè)是重要輸血試驗(yàn)組成部分[1]。傳統(tǒng)上， 這種檢測(cè)是在患者或供體單位紅細(xì)胞（RBCs）上進(jìn)行的， 使用的試劑抗血清具有明確的抗原特異性和凝集點(diǎn)。多種血型抗原的同種異體抗體與HDFN有關(guān)聯(lián)， 可見于ABO、RH及MN等血型系統(tǒng)。HDFN可能導(dǎo)致嚴(yán)重的溶血、黃疸和核黃疸。在我國， ABO相關(guān)HDFN比例最多， 而RH（-）人群僅占0.4%， 低于白種人15%[2]。其他血型系統(tǒng)則更為罕見。一旦發(fā)病， 病后預(yù)后極差， 所以先期診斷則顯得尤為關(guān)鍵。需要適當(dāng)?shù)脑\斷工具來區(qū)分HDFN與其他紅細(xì)胞相關(guān)原因的妊娠免疫和黃疸的肝或感染性病因。HDFN由于其高發(fā)病率和嚴(yán)重的臨床癥狀， 應(yīng)確保早發(fā)現(xiàn)、早治療。

【關(guān)鍵詞】 溶血性疾病;血型系統(tǒng);胎兒;新生兒;抗原;抗體

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.36.107

1 血清學(xué)方法

關(guān)于產(chǎn)前診斷， 如果發(fā)現(xiàn)有臨床意義上的同種異體抗體， 或者有前一個(gè)胎兒或新生兒受到HDFN的影響， 最初是通過確定胎兒RBCs中相應(yīng)抗原的存在與否來確定HDFN的胎兒風(fēng)險(xiǎn)[3]。

為預(yù)防及避免HDFN的發(fā)生， 妊娠婦女除行常規(guī)的產(chǎn)前檢查外， 還應(yīng)包括妊娠史、流產(chǎn)史、HDFN史及夫妻雙方的ABO和Rh血型的鑒定、不規(guī)則抗體篩選。而目前臨床檢測(cè)血型最為常用的方法， 其原理是讓待測(cè)樣本紅細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)血清中血型抗原和抗體在液體介質(zhì)中發(fā)生凝集反應(yīng)， 通過肉眼識(shí)別判斷血型表型。常用的方法有玻片法、試管法等。在此基礎(chǔ)上改良的微柱凝膠法[4]， 進(jìn)一步提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性， 且具有所需樣本少、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。盡管有研究表明[5]， HDFN的發(fā)病率隨母體內(nèi)抗-A/B或抗-RhD水平的升高而遞增， 但仍有一些高抗體水平的個(gè)體并沒有發(fā)生HDFN， 而一些低抗體水平的個(gè)體發(fā)生了中至重度的HDFN。對(duì)那些有過流產(chǎn)史、HDFN史的孕婦， 應(yīng)該密切注意其體內(nèi)的血清抗體水平。

血清學(xué)方法可用于孕婦在懷孕早期的弱抗體檢測(cè)， 血清學(xué)分析的優(yōu)勢(shì)來自于其敏感性和靈活性， 這使得在妊娠早期抗體滴度較低時(shí)即可發(fā)現(xiàn)和鑒定。但其局限性在于實(shí)驗(yàn)須在標(biāo)準(zhǔn)化條件下進(jìn)行， 且檢測(cè)出來的抗體滴度與HDFN疾病嚴(yán)重程度之間的相關(guān)關(guān)系仍然欠缺。另外， 對(duì)HEAs進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)還有其他局限性。例如， 需要抗原特異性抗原。在某種程度上， 這大概是因?yàn)榈味ǚńY(jié)果本身就是一種不精確的抗體濃度測(cè)量方法。同時(shí)， 對(duì)于許多臨床相關(guān)的HEAs， 也沒有商用的抗血清（如V抗原）。如果單個(gè)樣本必須檢測(cè)多個(gè)抗原， 那么特定的抗血清的成本依然比較昂貴。血清學(xué)檢測(cè)是人力成本較高， 需要有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員才能獲得與凝集測(cè)試的主觀終點(diǎn)一致的結(jié)果。

血清學(xué)類型的方法可能需要耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間， 并且需要穩(wěn)定可靠的抗血清。如前所述， 如果血液樣本中含有來自最近輸液的持續(xù)供體細(xì)胞， 或者通過間接凝集作用在樣本上使用陽性的直接抗人球蛋白試驗(yàn)（DAT）進(jìn)行輸入， 就不能在不修改的情況下使用它們。改良的血清學(xué)方法并不總是成功的， 它們不能用于某些常見的抗原。近年來， 分子分型（基因型測(cè)試）已成為一種替代方法， 可以克服血清型分型的許多缺點(diǎn)， 同時(shí)也能增加與輸血管理相關(guān)的新信息。

2 分子分型方法

在許多情況下， 這種血清學(xué)檢測(cè)有嚴(yán)重的局限性。而分子診斷測(cè)試方面的進(jìn)展， 克服了血清學(xué)檢測(cè)的局限性， 使實(shí)驗(yàn)室能夠檢測(cè)特定位點(diǎn)的編碼序列， 從而可以推斷出抗原的狀態(tài)。在分子水平上， 抗原變異是基于對(duì)HEA基因編碼的DNA序列變異， 如單核苷酸多態(tài)性（SNPs）、插入或缺失。例如， RHCE基因（676G>C） 密碼子226的單核苷酸變化是E/e等位基因的基礎(chǔ)[6]。

因此在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上， 開發(fā)了多種血型基因分型方法[7]， 常見的有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR法、擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度多態(tài)性PCR法、等位基因特異性引物消耗法、突變位點(diǎn)分離PCR法以及DNA芯片法、直接測(cè)序法等。當(dāng)父親為雜合或父系接合性未知時(shí)， 胎兒紅細(xì)胞抗原決定需要通過胎兒血型基因分型來進(jìn)行進(jìn)一步的管理。運(yùn)用PCR-序列特異性引物（SSP）、PCR-限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）等[8]分子生物學(xué)技術(shù)可從懷孕16周的孕婦羊水細(xì)胞中檢測(cè)出胎兒的血型基因， 對(duì)于有 HDFN 史或流產(chǎn)史的婦女， 其丈夫基因?yàn)殡s合型者， 用分子生物學(xué)技術(shù)可以更早、更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)胎兒的血型基因型， 可有選擇性終止RhD陽性胎兒的妊娠， 避免對(duì)RhD陰性胎兒的一些侵入性損害檢查[9]。可檢測(cè)的血型基因型有RhD、c、E、Cw、K、Fya、Fyb、Jka、Jkb 等。在 ABO HDFN 的預(yù)測(cè)中， 如母親為O型， 父親為AO /BO型的夫婦， 檢測(cè)其胎兒ABO血型基因型， 如胎兒為O型， 完全可以排除HDFN發(fā)生的可能， 避免其他不必要的檢測(cè)。如胎兒為AO/BO基因型， 則提示有發(fā)生HDFN的可能， 從而指導(dǎo)臨床在必要時(shí)進(jìn)行其他檢測(cè)。

盡管分子遺傳學(xué)在未來可能發(fā)揮更大的作用。但與所有的方法一樣， 分子抗原類型有其優(yōu)點(diǎn)， 但也有其局限性。因?yàn)榧夹g(shù)、醫(yī)學(xué)和遺傳缺陷導(dǎo)致表型（在紅細(xì)胞表面上表達(dá)的）與基因型（編碼基因）不同。大多數(shù)基于DNA的擴(kuò)增都不排除檢測(cè)中沒有表達(dá)的基因， 這可能導(dǎo)致抗原檢測(cè)假陽性。另一方面， 不是所有的血型多態(tài)性都可以很容易的分析[10]， 例如， 如果大量的等位基因編碼一個(gè)表型（例如ABO、Rh和null表型）;或具有大片段缺失的等位基因（如Ge-）或由混合基因編碼的等位基因（例如在Rh和MNS系統(tǒng)中）;或者當(dāng)分子基礎(chǔ)未知時(shí)（例如Vel、Lan、Jra）。此外， 并不是所有種族的所有等位基因都是已知的[11]。

3 標(biāo)本采集

胎兒血型基因分型樣本來源于幾種胎兒DNA。傳統(tǒng)上包括羊膜穿刺術(shù)、臍帶穿刺術(shù)和絨毛膜絨毛取樣（CVS）和經(jīng)陰道灌洗獲得的子宮頸組織的胎兒細(xì)胞。每一種都對(duì)胎兒有風(fēng)險(xiǎn)， 而且與樣品質(zhì)量有關(guān)。經(jīng)陰道灌洗獲得的宮頸組織則胎兒DNA的豐度低， 而母體DNA、羊膜穿刺術(shù)、角膜穿刺術(shù)和CVS感染的可能性較高， 并增加了妊娠期出血的風(fēng)險(xiǎn)， 增加了母體致敏的風(fēng)險(xiǎn)。以往， 羊膜細(xì)胞是胎兒血型基因分型的首選來源， 因?yàn)橄鄬?duì)于其他方法， 羊膜穿刺術(shù)的安全性較好。然而， 即使是羊膜穿刺術(shù)也有0.3%～1.0%的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)和3%～17%的胎盤出血[12]。早期產(chǎn)前診斷胎兒DNA的非侵入性產(chǎn)前診斷方法的出現(xiàn)， 已經(jīng)消除了這些擔(dān)憂， 并極大地提高了對(duì)胎兒組織進(jìn)行分子檢測(cè)的能力。

在過去的幾十年里， 監(jiān)測(cè)胎兒危險(xiǎn)的侵入性程序已經(jīng)被放棄。胎兒血型分型可在妊娠期間孕婦血漿中使用無細(xì)胞胎兒DNA。胎兒貧血可通過多普勒超聲檢查， 以確定需要宮內(nèi)輸血的胎兒。最后， 強(qiáng)化光療法是一種安全的干預(yù)手段， 以降低膽紅素水平， 以預(yù)防核黃疸。由于母體抗體在這一時(shí)期保持活躍， 受感染的新生兒在出生后的幾個(gè)月可能需要一次或更多的輸血。

4 未來趨勢(shì)

在血型分類中， 最有潛力但依然在實(shí)驗(yàn)階段的新方法是診斷微陣列的發(fā)展。DNA以及蛋白質(zhì)和碳水化合物微陣列依然處于實(shí)驗(yàn)階段。最大的影響可能來自于目前進(jìn)行的各種類型的常規(guī)化驗(yàn)， 包括血型分型和血液捐獻(xiàn)的病原體檢測(cè)。微陣列有可能改變這些測(cè)試算法， 以在單個(gè)平臺(tái)上同時(shí)測(cè)試所有需要的標(biāo)記， 減少使用專用操作符和特定試劑的多種儀器的成本， 并大大簡(jiǎn)化了數(shù)據(jù)處理方面的操作。

如上所述， 大多數(shù)血型抗原都是等位基因， 是SNP的結(jié)果。對(duì)于DNA微陣列， DNA分離后的多重PCR擴(kuò)增了含有SNPs的基因片段。然后將PCR產(chǎn)物雜交到一個(gè)含有短等位基因寡核苷酸的陣列中。對(duì)于每一個(gè)血型， 都有不同的寡核苷酸（正義和反義）。然后用自顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)對(duì)整個(gè)陣列進(jìn)行可視化處理， 陣列信息進(jìn)行解碼， 基因型得分。首次結(jié)果表明， 微陣列將提供一個(gè)可靠且快速的程序， 可以進(jìn)一步改進(jìn)以提高效率。為測(cè)定血型， 研制了蛋白質(zhì)微陣列， 它們是用多種血型抗原特異性抗體標(biāo)記的。該方法也可用于直接抗球蛋白檢測(cè)的微陣列中， 在微陣列表面發(fā)現(xiàn)單克隆抗免疫球蛋白G（IgG）和抗C3d， 并在熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記的熒光素中， 使敏感的RBCs反應(yīng)。碳水化合物微陣列包含許多不同的多糖， 以一種小型化的形式固定在固體支架上。在相同的條件下， 可以同時(shí)對(duì)陣列中的每個(gè)組件的蛋白質(zhì)、病毒或細(xì)胞進(jìn)行綁定。使用含有不同糖蛋白的碳水化合物微陣列， 可以檢測(cè)出A、B、H和Lewis血型的抗體。

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[收稿日期：2019-03-13]