尚平平，華辰鳳，謝復(fù)煒，李 翔*

（中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州450001）

卷煙煙氣是含有6 000多種化學(xué)成分的復(fù)雜氣溶膠，其中有69種表現(xiàn)出遺傳毒性[1]，目前，卷煙煙氣的危害評(píng)價(jià)主要以體外毒性試驗(yàn)為主。體外毒性試驗(yàn)具有周期短，靈敏度高等特點(diǎn)，是反映卷煙風(fēng)險(xiǎn)的有力手段，在卷煙煙氣的危害評(píng)價(jià)中具有重要作用[2]。在進(jìn)行卷煙煙氣危害評(píng)價(jià)時(shí)，國(guó)內(nèi)外多采用Ames試驗(yàn)和體外微核試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)其遺傳毒性[3]。近年來(lái)，TK基因突變?cè)囼?yàn)因具有檢測(cè)譜較廣、檢出靈敏度較高、簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)，得到了較快發(fā)展和不斷完善。歐盟、美國(guó)和中國(guó)在進(jìn)行食品添加劑、食品接觸材料用物質(zhì)、藥品、化妝品等安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)，也將其作為必選或備選的遺傳毒性試驗(yàn)方法之一。

吸煙與健康一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)，隨著世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)布的《煙草控制框架公約》逐漸實(shí)施生效，中國(guó)煙草在卷煙降焦減害方面開展了大量研究工作[4]，從煙葉原料、卷煙配方、輔助材料和加工工藝等方面降低卷煙煙氣的危害，研制了低焦油卷煙、動(dòng)植物提取物添加卷煙[5]、減害功能材料添加卷煙等[6]。而如何比較不同卷煙的遺傳毒性強(qiáng)度的差異，國(guó)內(nèi)外均進(jìn)行了探索性研究[7-9]。

我們將不同焦油釋放量的卷煙，采用標(biāo)準(zhǔn)抽吸條件下收集的卷煙煙氣冷凝物（cigarette smoke condensate，CSC）對(duì)L5178Y tk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤細(xì)胞進(jìn)行染毒，計(jì)算各卷煙樣品的三氟胸苷抗突變頻率（trifluorothymidine resistance mutation frequency，TMF），利用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，初步比較不同卷煙樣品的TK基因致突變能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物及主要試劑 盒標(biāo)焦油分別為5、8和11 mg的1、2和3號(hào)市售卷煙，馬血清（批號(hào)1856573）和RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)1924300）均購(gòu)自Gibco公司，胸腺嘧啶核苷（批號(hào)WXBC1817V）、氨甲碟呤（SLBK2839V）、次黃嘌呤（批號(hào) SLBD4750V）、甘氨酸（批號(hào) BCBM6203V）、三氟胸苷（批號(hào) BCBL1812V）、環(huán)磷酰胺（批號(hào)068K1131）均購(gòu)自Sigma公司，SD大鼠肝S9購(gòu)自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號(hào)S10013）；二甲基亞砜購(gòu)自上海翊圣生物有限公司（批號(hào)D0306）。

1.1.2 細(xì)胞株 L5178Y tk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤細(xì)胞，由解放軍疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心贈(zèng)送。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) L5178Y tk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤細(xì)胞在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下常規(guī)懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為1×106/mL，采用含10%馬血清和適量抗菌素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在96孔板上表達(dá)培養(yǎng)時(shí)采用含20%馬血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.2.2 自發(fā)突變清除 為避免細(xì)胞的自發(fā)突變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，在正式實(shí)驗(yàn)前，進(jìn)行自發(fā)突變清除工作。用含3 g/mL胸腺嘧啶核苷、5 g/mL次黃嘌呤、0.1 g/mL氨甲碟呤和7.5 g/mL甘氨酸的THMG培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，800 r/min離心5 min，洗滌后在不含氨甲碟呤的THG培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d。

1.2.3 受試物處理 卷煙樣品在（22±2）℃、相對(duì)濕度（60±3）%的環(huán)境下平衡48 h后，并在此環(huán)境下采用ISO 4387抽吸方法（抽吸容量35 mL，每次抽吸2 s，每60 s抽吸一次）于轉(zhuǎn)盤吸煙機(jī)抽吸3個(gè)卷煙樣品各20支，抽吸結(jié)束后，用DMSO以10 mg/mL萃取濾片上的CSC，-80℃保存待用。

1.2.4 染毒 根據(jù)細(xì)胞毒性的相對(duì)存活率確定的試驗(yàn)劑量分別為20、40、80、100、150μg/mL，取生長(zhǎng)良好的L5178Y細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，按1%體積加入受試物CSC。陽(yáng)性對(duì)照組加入環(huán)磷酰胺，陰性對(duì)照組加入DMSO。37℃振搖處理3 h。800 r/min離心5 min后，棄上清液，用不含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2遍，重懸細(xì)胞于含10%馬血清的培養(yǎng)基中。

1.2.5 第0天平板接種效率的測(cè)定 按每毫升8個(gè)細(xì)胞，接種96孔板（每孔加0.2 mL，即平均每孔1.6個(gè)細(xì)胞），每個(gè)劑量作2塊板，37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度條件下培養(yǎng)12 d，計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù)，計(jì)算第0天平板接種效率（PE0）。

式中EW為無(wú)集落生長(zhǎng)的孔數(shù)，TW為總孔數(shù)，1.6為每孔接種細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 表達(dá)培養(yǎng)2 d平板接種效率的測(cè)定 將細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，48 h表達(dá)培養(yǎng)（每天計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度并保持濃度在1×106/mL以下）后，計(jì)算相對(duì)懸浮生長(zhǎng)（RSG）和相對(duì)總生長(zhǎng)（RTG）。

式中RS2為第2天的相對(duì)存活率。

然后按照PE0的方法接種96孔板，培養(yǎng)12 d后，計(jì)算PE2，方法同PE0。

1.2.7 TFT抗性突變頻率測(cè)定 48 h表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，加入終濃度為3 g/mL的三氟胸苷，混勻，接種96孔板（每孔加0.2 mL），每個(gè)劑量作2塊板培養(yǎng)12 d后，計(jì)數(shù)有突變集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。

式中EW為無(wú)集落生長(zhǎng)的孔數(shù)，TW為總孔數(shù)，n為每孔接種細(xì)胞數(shù)（2 000），PE2為表達(dá)培養(yǎng)2 d的平板效率。

1.2.8 致突變能力比較 當(dāng)受試物有致突變陽(yáng)性作用時(shí)，將卷煙煙氣各劑量的TMF繪制劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線，直線部分的斜率即為致突變強(qiáng)度。直線部分的選擇依據(jù)SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析，首先對(duì)TMF數(shù)據(jù)進(jìn)行一元二次（一元二次方程為y?=a1x2+b1x+c1）線性擬合。二次項(xiàng)系數(shù)a1用于評(píng)價(jià)模型的顯著性，當(dāng)a1有明顯顯著性時(shí)，去掉高劑量數(shù)據(jù)，剩余數(shù)據(jù)再進(jìn)行一元二次線性擬合，直至a1無(wú)顯著性。對(duì)剩余數(shù)據(jù)進(jìn)行一元直線（y?=b2x+c2）回歸模擬，其中，b2為致突變強(qiáng)度[8]。

2 結(jié)果

3種卷煙樣品信息及煙氣冷凝物的常規(guī)化學(xué)分析數(shù)據(jù)見表1，實(shí)測(cè)的焦油含量和煙堿含量與盒標(biāo)一致或低于盒標(biāo)。

表1 3種卷煙樣品的信息及煙氣冷凝物的常規(guī)化學(xué)分析數(shù)據(jù)

3種卷煙樣品的煙氣冷凝物TK基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果見表2，陽(yáng)性對(duì)照CP的TMF顯著高于溶劑對(duì)照組（P＜0.01）。隨受試物劑量增加，RSG和RTG呈下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出良好的劑量-反應(yīng)關(guān)系。1號(hào)樣品在劑量為150 μg/mL、2號(hào)樣品和3號(hào)樣品在劑量為100μg/mL時(shí)，TMF是溶劑對(duì)照組3倍以上，并且隨著CSC劑量的增加，TMF呈上升趨勢(shì)。在本試驗(yàn)條件下，CSC對(duì)L5158Y細(xì)胞的TK基因有致突變作用。3種卷煙樣品的TK基因致突變強(qiáng)度分別為0.37、0.36和0.38，表明卷煙煙氣的TK基因致突變能力與焦油釋放量無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。

3 討論

卷煙煙氣含有多種遺傳毒性有害成分，如4-（N-甲基-N-亞硝氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮、苯并芘等，目前國(guó)內(nèi)外從基因突變[10-11]、染色體和染色體組畸變[12-14]、DNA損傷[15-16]等方面來(lái)評(píng)價(jià)卷煙煙氣的遺傳毒性。國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心煙草煙氣體外毒性測(cè)試工作組推薦采用Ames試驗(yàn)和體外微核試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)卷煙煙氣的危害，但僅采用這兩種遺傳毒性試驗(yàn)是不全面的。

表2 卷煙樣品煙氣冷凝物的TK致突變頻率測(cè)定結(jié)果

國(guó)際上至今已發(fā)展了使用不同生物材料的多種類型體內(nèi)、體外遺傳毒性測(cè)試試驗(yàn)，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織有指導(dǎo)方針的遺傳毒性試驗(yàn)共15項(xiàng)。這些試驗(yàn)各具優(yōu)缺點(diǎn)，但尚未發(fā)現(xiàn)單一的一種試驗(yàn)在檢測(cè)終點(diǎn)覆蓋范圍、靈敏度和特異性等方面均能達(dá)到令人滿意的程度。因此，國(guó)內(nèi)外均一致認(rèn)為只有使用一組試驗(yàn)方法才能對(duì)受試物的遺傳毒性作出較為可靠評(píng)價(jià)。與其他常用的短期致突變?cè)囼?yàn)相比，TK基因突變?cè)囼?yàn)檢測(cè)的遺傳學(xué)終點(diǎn)非常豐富，可檢出的遺傳毒性包括點(diǎn)突變、缺失、置換、基因增殖、雜合等多種遺傳學(xué)損傷，這是Ames試驗(yàn)和體外微核試驗(yàn)無(wú)法比擬的。同時(shí)該試驗(yàn)具有高靈敏度和簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)，也是歐盟、美國(guó)和中國(guó)在藥物、食品安全性評(píng)價(jià)時(shí)的必選或備選遺傳毒性試驗(yàn)方法。

TK基因突變?cè)囼?yàn)是Clive和Spector于1975年創(chuàng)建的方法，利用突變細(xì)胞對(duì)嘧啶類似物表現(xiàn)出抗性而存活的特點(diǎn)對(duì)TK突變體進(jìn)行選擇，從而檢測(cè)化學(xué)物或其他環(huán)境因素的誘變性[17]。卷煙煙氣在多種遺傳毒性試驗(yàn)中表現(xiàn)出陽(yáng)性作用[2]，TK基因突變?cè)囼?yàn)發(fā)展的完善，使得國(guó)際上開始采用TK基因突變?cè)囼?yàn)來(lái)檢測(cè)卷煙煙氣的致突變性，美國(guó)FDA曾于2011對(duì)1種參比卷煙和10種市售卷煙進(jìn)行小鼠淋巴瘤細(xì)胞的TK基因致突變?cè)囼?yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11種卷煙的煙氣冷凝物均表現(xiàn)出致突變作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)致突變強(qiáng)度與焦油釋放量無(wú)相關(guān)關(guān)系[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)焦油釋放量的增加，并未直接導(dǎo)致卷煙煙氣致突變能力的增加，這在流行病學(xué)的研究中得到了支持，這些研究表明，抽吸中焦油（14.5 mg）、 低 焦 油 （6.5～14.5 mg）和 超 低 焦 油 （＜6.5 mg）[18-19]吸煙者的致肺癌物質(zhì)的暴露和患肺癌風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯差別，表明卷煙煙氣的遺傳毒性并不單純依賴于焦油量影響。事實(shí)上，卷煙煙氣含有100多種有害成分，而焦油中的有害成分可能因煙草特性、卷煙的物理及化學(xué)特征及吸煙行為而異（即吸煙者的抽吸次數(shù)、抽吸體積及抽吸持續(xù)時(shí)間等）[20]。

總之，本研究表明，小鼠淋巴瘤細(xì)胞TK基因突變?cè)囼?yàn)可以評(píng)估卷煙煙氣的遺傳毒性，同時(shí)，卷煙煙氣對(duì)TK基因的致突變能力與焦油釋放量無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系。