熊 強(qiáng)，丁立新，姜曉燕，丁庫(kù)克*

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)中心放射生態(tài)研究室，北京 100088）

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要執(zhí)行者之一，正確且完整的結(jié)構(gòu)是保證其正常功能發(fā)揮的前提，因此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究是目前最熱門的研究領(lǐng)域之一。對(duì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的研究，一方面對(duì)于深入了解生物體內(nèi)的生命過(guò)程有重要意義，另一方面對(duì)于重大疾病的預(yù)防和治療、新型高效藥物和疫苗的研發(fā)等有重要的作用。目前測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)方法主要有X射線晶體衍射技術(shù)（X-ray crystalline diffraction）、多維核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和低溫冷凍電鏡等[1]（表 1）。NMR 對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量很大的生物大分子的分辨能力有限，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)無(wú)法解析，同時(shí)制備同位素置換樣品是一件昂貴且費(fèi)時(shí)的工作；低溫冷凍電鏡方法近年來(lái)在解析膜蛋白和大型蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)方面受到很多研究者的青睞，但是由于獲得足夠大小的晶體比較困難，電子與蛋白質(zhì)相互作用，發(fā)生多重散射使得其內(nèi)部結(jié)構(gòu)分辨率較低等，目前最常用和最準(zhǔn)確的測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的手段仍是X射線晶體衍射技術(shù)[2]。截至2017年12月31日，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank，PDB）中儲(chǔ)存了126 690條蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，其中114 421條是通過(guò)X射線測(cè)得的，約占90%。

表1 3種測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方法的比較

1 X射線測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的原理

在解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中應(yīng)用的是波長(zhǎng)在1?左右的X射線，由于該波長(zhǎng)與蛋白質(zhì)晶體內(nèi)原子間距離的數(shù)量級(jí)相同，且晶體結(jié)構(gòu)內(nèi)分子規(guī)律性排列，當(dāng)X射線入射到晶體上時(shí)，晶體中的每一個(gè)原子都發(fā)射出次生的X射線相互干涉迭加，并產(chǎn)生強(qiáng)X射線衍射[3]。這個(gè)過(guò)程與光學(xué)顯微鏡成像有相似之處：顯微鏡物鏡匯聚從被觀測(cè)物體表面反射的散射光而成像。對(duì)于X射線來(lái)說(shuō)，雖然沒(méi)有一種材料可以直接作為物鏡匯聚散射光形成物像，但是晶體的衍射現(xiàn)象與晶體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，即衍射方向與晶體內(nèi)晶胞的形狀、大小有關(guān)，而衍射的強(qiáng)度與重金屬原子在晶胞中的排列方式、周期等特點(diǎn)有關(guān)[4]。

與人的指紋相似，晶體衍射圖譜衍射線的分布位置和強(qiáng)度有著特征性規(guī)律。通過(guò)分析晶體內(nèi)衍射點(diǎn)的排列方式和點(diǎn)間距離的大小來(lái)推算分子在晶體結(jié)構(gòu)中的排列方式和重復(fù)周期的長(zhǎng)短；通過(guò)測(cè)量衍射強(qiáng)度，借助電子計(jì)算機(jī)，結(jié)合一系列數(shù)學(xué)方法，可算出分子內(nèi)每個(gè)原子在空間的坐標(biāo)，從而測(cè)定整個(gè)分子的晶體結(jié)構(gòu)[5]。

2 X射線應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的發(fā)展

自Rontgen發(fā)現(xiàn)X射線以后，越來(lái)越多的物理學(xué)家開(kāi)始探索其性質(zhì)和應(yīng)用。1934年，Bemal和Crowfoot獲得了第1張蛋白質(zhì)晶體的X衍射照片，但是當(dāng)時(shí)理論比較局限，無(wú)法解決蛋白質(zhì)大分子晶體衍射的相位問(wèn)題。直到1953年英國(guó)的晶體學(xué)家Perutz和他的同事提出將重金屬原子引入蛋白質(zhì)晶體中，通過(guò)多對(duì)同晶置換法（multiple isomorphous replacement，MIR）解決相位問(wèn)題，才從理論上實(shí)現(xiàn)測(cè)定蛋白質(zhì)大分子晶體結(jié)構(gòu)的可能性。后來(lái)Kendrew和Perutz分別利用這種方法得到了鯨肌紅蛋白和馬血紅蛋白的低分辨率晶體結(jié)構(gòu)[6-7]，自此X射線晶體衍射技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定中得到了實(shí)際應(yīng)用。事實(shí)上，第1個(gè)用X射線晶體衍射技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)并解釋分子機(jī)制的是溶菌酶，Blake和Phillips分別在1965和1966年測(cè)出其三維結(jié)構(gòu)并詳細(xì)闡明了其作用機(jī)制[8-9]。

3 同步輻射

1961年，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局在同步加速器真空盒切線方向上附加了一個(gè)真空裝置，建造了第1個(gè)用于紫外輻射的同步輻射裝置，該裝置的成功建設(shè)引起了在世界范圍內(nèi)將同步輻射作為X射線光源的興趣。1981年美國(guó)的第2代同步輻射裝置（NSLSII）建成了世界上第1條用于測(cè)定蛋白質(zhì)等生物大分子晶體結(jié)構(gòu)線站，此后世界各地的同步輻射裝置紛紛建立了蛋白質(zhì)晶體學(xué)線站。同步輻射因?yàn)閾碛袠O高的強(qiáng)度、很好的準(zhǔn)直性和方便可調(diào)的入射X射線等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)晶體解析方面有巨大的應(yīng)用潛能。

3.1 相位問(wèn)題

解決相位問(wèn)題是蛋白質(zhì)晶體分析過(guò)程中最重要的步驟之一，同時(shí)也是最困難的地方。由于同步輻射能夠靈活改變X射線波長(zhǎng)，為解決相位問(wèn)題提供了一種有力的工具——反常散射。Venkatraman Ramakrishnan，Thomas A.Steitz和Ada E.Yonath 3位科學(xué)家因在核糖體結(jié)構(gòu)和功能方面作出杰出貢獻(xiàn)而被授予2009年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，在公告材料中指出，由于同步輻射可調(diào)波長(zhǎng)的特性，可以利用反常散射來(lái)確定相位。Doutch等[10]在研究三聚類裂環(huán)無(wú)色桿菌亞硝酸還原酶（achromobacter cycloclastes nitrite reductase，AcNiR）時(shí)，利用蛋白質(zhì)固有元素硫的單波長(zhǎng)反常衍射（single-wavelength anomalous diffraction，SAD）來(lái)解決相位問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)用較短的波長(zhǎng)就可以得到比較理想的結(jié)構(gòu)。Harada等[11]研究含血紅素鐵的虹螺桿菌的原生細(xì)胞色素C時(shí)，利用晶體中鐵的多波長(zhǎng)反常衍射（multiwavelength anomalous diffraction，MAD）來(lái)確定相位。SAD和MAD是目前最常用的解決相位問(wèn)題的方法，但是由于晶體內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂、輻射損傷和其他能引起反常衍射的原子等原因，單個(gè)晶體的反常衍射常常有一定的誤差。2011年Liu等[12]利用多個(gè)晶體的反常衍射數(shù)據(jù)解決相位問(wèn)題，在結(jié)構(gòu)建立、電子密度圖和精化等方面都有所提高。

3.2 小角X射線散射

20世紀(jì)70年代之前，小角X射線散射（small angle X-ray scattering，SAXS）由于光源的原因發(fā)展非常緩慢。直到80年代以后，同步輻射作為SAXS的光源，提供了極高的入射光強(qiáng)度，有效減小了光斑，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的快速曝光，使得SAXS在蛋白質(zhì)溶液結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化中得到廣泛的應(yīng)用。Li等[13]利用SAXS研究玉米醇溶蛋白（zein）時(shí)，觀察到了該蛋白在不同溶劑中的尺寸形狀和分散狀態(tài)，從而得到了蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象等信息。蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，用SAXS解析蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)時(shí)需要聯(lián)合其他手段。Zhang等[14]研究細(xì)菌的四型酰胺酶效應(yīng)因子（type VI amidase effector，Tae4）和免疫因子（type VI amidase immunity，Tai4）形成的復(fù)合物時(shí)，利用SAXS和分析超速離心，觀察到該復(fù)合物是一個(gè)四聚體，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了這4個(gè)單體之間相互結(jié)合的機(jī)制。Sonderby等[15]研究了38對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合結(jié)構(gòu)，通過(guò)聯(lián)合SAXS和網(wǎng)絡(luò)對(duì)接模擬數(shù)據(jù)，更加便利地得到蛋白質(zhì)復(fù)合體在溶液中的構(gòu)象和三維結(jié)構(gòu)。近幾年，SAXS的飛速發(fā)展也使得一大批針對(duì)SAXS的實(shí)驗(yàn)設(shè)備隨之產(chǎn)話生[16]。

3.3 串行晶體學(xué)

串行飛秒晶體學(xué)（serial femtosecond crystallography，SFX）是在X射線自由電子激光（X-ray free-electron laser，XFEL）出現(xiàn)后發(fā)展起來(lái)的一種新型解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法。但是由于目前世界上僅有5臺(tái)XFEL裝置能開(kāi)展SFX，而現(xiàn)在最先進(jìn)的第三代同步輻射光源已經(jīng)超過(guò)了20臺(tái)，所以基于同步輻射的串行晶體學(xué)（serial synchrotron crystallography，SSX）逐漸被重視，且發(fā)展迅速。SSX用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析上具有可在室溫下收集衍射數(shù)據(jù)、能解析微小晶體結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)。Stellato和Botha的團(tuán)隊(duì)在室溫下用SSX分別照射油脂相中的膜蛋白和毛細(xì)管中流動(dòng)的晶體獲得了衍射數(shù)據(jù)[17-18]。Coquelle等[19]通過(guò)掃描固定域薄硅片上隨機(jī)取向的晶體，獲得母雞卵白溶解酵素（hen egg-white lysozyme，HEWL）微小晶體高分辨率結(jié)構(gòu)信息。在SSX的各種研究方法中，最常用的是將晶體固定在微流體芯片等基片上，從而收集基片上每個(gè)晶體的衍射數(shù)據(jù)，這對(duì)蛋白質(zhì)微小晶體的解析有重要意義[20]。

4 X射線自由電子激光

2009年，美國(guó)SLAC國(guó)家實(shí)驗(yàn)室建成了世界上第1臺(tái)X射線自由電子激光裝置LCLS。XFEL是一種新型的、完全相干的X射線，其工作原理和同步輻射完全不一樣，它的出現(xiàn)，為解析物質(zhì)結(jié)構(gòu)提供了一種全新的方法。因?yàn)閄FEL擁有高強(qiáng)度、超短時(shí)間脈沖，可用于解析微小晶體或者無(wú)法結(jié)晶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，同時(shí)也可以在晶體受到輻射損傷之前獲得衍射圖案。

4.1 微小晶體

傳統(tǒng)的X射線晶體衍射技術(shù)需要增大入射強(qiáng)度來(lái)記錄微小晶體的衍射數(shù)據(jù)，這樣對(duì)晶體的損害較大?，F(xiàn)在通過(guò)將懸浮有大量微小晶體的溶液約束成射流，不斷傳送到光照區(qū)，SFX同步監(jiān)控收集衍射數(shù)據(jù)[21]。Chapman和他的同事用硬XFEL的飛秒脈沖收集了300萬(wàn)張衍射圖案，使用脈沖頻率比絕大多數(shù)輻射損害的時(shí)間尺度要短，減輕了輻射損傷的問(wèn)題[22]。牛細(xì)胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CcO）是一個(gè)高輻射敏感的蛋白，Hirata等[23]通過(guò)對(duì)比XFEL和同步輻射對(duì)CcO中過(guò)氧化物配體的輻射損傷，發(fā)現(xiàn)XFEL對(duì)CcO基本無(wú)損傷。

4.2 膜蛋白

膜蛋白由于其疏水特性，與生物膜結(jié)合成穩(wěn)定的自然構(gòu)象，難以形成足夠大和高純度的晶體。在XFEL基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的SFX使得膜蛋白的結(jié)構(gòu)解析成為可能，其中最熱門和最早解析的是G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors，GPCRs）[24]。SFX解析膜蛋白結(jié)構(gòu)時(shí)，一般是通過(guò)收集膜蛋白在脂立方相（lipidic cubic phase，LCP）中晶體的衍射數(shù)據(jù)來(lái)解析膜蛋白結(jié)構(gòu)，例如K+通道[25]、Na+/Ca2+泵[26]等膜蛋白結(jié)構(gòu)的解析。然而，受限于XFEL的發(fā)展，SFX并不是作為膜蛋白結(jié)構(gòu)解析的常規(guī)方法。

4.3 時(shí)間分辨測(cè)量方法

在生物學(xué)分子結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究中只有提及功能，結(jié)構(gòu)的變化才顯得有意義。隨著XFEL的發(fā)展，延伸出來(lái)了通過(guò)時(shí)間維度和時(shí)間分辨收集數(shù)據(jù)的方法來(lái)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，了解大分子的快速動(dòng)力學(xué)。該方法是通過(guò)一種叫“泵－探針”的實(shí)驗(yàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，光敏感分子通過(guò)一束激光（泵）觸發(fā)時(shí)間依賴的變化，在一定的時(shí)間間隔內(nèi)，結(jié)構(gòu)變化通過(guò)X射線脈沖（探針）來(lái)檢測(cè)。這項(xiàng)技術(shù)被用在觀察一氧化碳的光解作用來(lái)探索肌紅蛋白（myoglobin）和血紅蛋白（hemoglobin）結(jié)構(gòu)變化[27-28]。Schotte等[29]在觀察光敏感黃蛋白（photoactive yellow protein，PYP）順式－反式的光異構(gòu)化的轉(zhuǎn)變時(shí)，觀察到了一個(gè)順式中間體。這個(gè)中間體存在的時(shí)間極其短暫，只有600 ps，而這個(gè)實(shí)驗(yàn)最短能觀察到100 ps的變化。不僅如此，XFEL也可以實(shí)現(xiàn)fs級(jí)別的檢測(cè)范圍。一個(gè)研究一氧化碳肌紅蛋白的實(shí)驗(yàn)觀察到了ps級(jí)別的螺旋運(yùn)動(dòng)，這也揭示XFEL在探測(cè)超快運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象中的潛能[30]。

5 總結(jié)與展望

如上所述，在過(guò)去的幾十年中，高分辨率結(jié)構(gòu)分析的X射線工具已大量涌現(xiàn)，讓我們可以在原子水平上解決生物分子相互作用及其機(jī)制。同步輻射和XFEL從某種程度上說(shuō)是互補(bǔ)的兩種光源。目前同步輻射主要解析的是靜態(tài)或微動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，XFEL則可以提供ps量級(jí)甚至fs量級(jí)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。而且二者都擁有相對(duì)高能量、短脈沖的特點(diǎn)，能夠解析微小晶體和膜蛋白結(jié)構(gòu)，甚至能實(shí)現(xiàn)“不需要晶體的結(jié)構(gòu)解析”。不難看出，今后X射線光源會(huì)朝著更高強(qiáng)度更短脈沖的方向發(fā)展，我們相信隨著第三代同步輻射、XFEL的發(fā)展，甚至新光源的出現(xiàn)，目前存在的難題會(huì)迎刃而解，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析也會(huì)上升至一個(gè)新的高度。