陳煒昊，田志龍，孫 偉，儲(chǔ)明星

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng) 471003）

綿羊產(chǎn)羔性狀遺傳力只有0.05～0.15，常規(guī)育種手段難以滿足現(xiàn)代畜牧業(yè)對(duì)于產(chǎn)羔性狀改良的需求［1］。標(biāo)記輔助選擇能夠極大地提高如綿羊產(chǎn)羔性狀這樣低遺傳力性狀的選擇效率，而找到與產(chǎn)羔性狀位點(diǎn)相連鎖的標(biāo)記，則是實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)［2］。研究表明，綿羊?qū)儆诩竟?jié)性繁殖動(dòng)物，在光照逐漸縮短的秋冬季節(jié)開始性腺活動(dòng)，在冬春之交時(shí)結(jié)束［3］。綿羊季節(jié)性繁殖活動(dòng)受下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）系統(tǒng)的調(diào)控［4］，與生殖激素的變化密切相關(guān)。促性腺激素釋放激素（GnRH）的釋放與卵巢生殖活動(dòng)的季節(jié)性變化聯(lián)系緊密，乏情期下丘腦GnRH 對(duì)雌激素的負(fù)反饋?lái)憫?yīng)迅速增加，進(jìn)而調(diào)控綿羊的季節(jié)性繁殖［5］。

卵泡抑素樣蛋白3（Follistatin-like protein 3，F(xiàn)STL3），又名卵泡抑素相關(guān)基因蛋白（Follistatin related-gene，F(xiàn)LRG）。綿羊FSTL3基因定位于5 號(hào)染色體上，共編碼263 個(gè)氨基酸，包含5 個(gè)外顯子［6］。FSTL3基因大量表達(dá)于胎盤、睪丸、心臟和胰腺等組織中，與生殖功能的調(diào)控密切相關(guān)［7］。FSTL3基因在維持妊娠方面也扮演了重要角色［8］，在大鼠懷孕后期，子宮和蛻膜中的FSTL3表達(dá)水平顯著升高，并且胎盤中FSTL3的mRNA 水平顯著高于卵巢［9］，在女性月經(jīng)周期和懷孕初期，子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細(xì)胞FSTL3表達(dá)水平顯著升高［10］，分娩時(shí)血清中FSTL3表達(dá)水平顯著增長(zhǎng)［11］。因此，推測(cè)FSTL3基因可能同樣對(duì)于綿羊的繁殖性狀有一定的影響。本研究針對(duì)不同發(fā)情模式的綿羊品種（季節(jié)性發(fā)情和常年發(fā)情），通過(guò)對(duì)綿羊FSTL3基因的測(cè)序，探討其多態(tài)位點(diǎn)與綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性，尋找新的多態(tài)位點(diǎn)，為進(jìn)一步開展綿羊產(chǎn)羔機(jī)理的研究和分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 血樣及數(shù)據(jù)采集

21 只蘇尼特羊血液樣本采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗民羊牧業(yè)有限責(zé)任公司，22 只灘羊血液樣本采自寧夏鹽池縣寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司，161只草原藏羊血液樣本采自西藏當(dāng)雄縣，101 只湖羊血液樣本采自江蘇省徐州申寧羊業(yè)有限公司，52 只策勒黑羊血液樣本采自新疆和田市策勒縣，380 只小尾寒羊血液樣品采自山東省鄆城縣誠(chéng)聯(lián)小尾寒羊種羊場(chǎng)。所有羊只均采用頸靜脈采血，檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。同時(shí)記錄小尾寒羊產(chǎn)羔季節(jié)、胎次與產(chǎn)羔數(shù)。

1.2 DNA 提取

使用TIANGEN（天根）血液DNA 試劑盒提取試驗(yàn)綿羊血液樣本DNA，Nano Drop2000 檢測(cè)DNA 樣本濃度，并使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量。

1.3 基因分型

對(duì)FSTL3基因g.40674542C＞T 位點(diǎn)在常年發(fā)情和季節(jié)性發(fā)情綿羊品種中進(jìn)行基因分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP 技術(shù)對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)［12］。分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量20 μL，DNA 濃度40～80 ng/μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016 軟件統(tǒng)計(jì)綿羊FSTL3基因g.40674542C＞T 位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量、雜合度和有效等位基因數(shù)。隨后進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)。

使用最小二乘法進(jìn)行小尾寒羊FSTL3不同基因型之間的分析，建立的線性模型為：

式中，yijkl為產(chǎn)羔數(shù)的記錄值；μ 為群體平均值；LSi為第i個(gè)產(chǎn)羔季節(jié)的固定效應(yīng)；Pj為第j個(gè)胎次的固定效應(yīng)；Gk為FSTL3基因第k種基因型的固定效應(yīng)；eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)。使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行小尾寒羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSTL3 基因多態(tài)性分析

由圖1 可知，F(xiàn)STL3基因g.40674542C＞T 位點(diǎn)在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中均存在CC、TC 和TT三種基因型。

從表1 可知，綿羊FSTL3基因g.40674542C＞T 位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種間差異均不顯著（P＞0.05），且在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中C 均為優(yōu)勢(shì)等位基因。

圖1 FSTL3 基因g.40674542C＞T 位點(diǎn)分型結(jié)果

表1 FSTL3 基因g.40674542C＞T 位點(diǎn)在季節(jié)性發(fā)情、常年發(fā)情綿羊品種中的基因型頻率和等位基因頻率

從表2 可知，綿羊FSTL3基因g.40674542C>T 位點(diǎn)在6 個(gè)綿羊品種中均表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC<0.25）?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，該位點(diǎn)在小尾寒羊、湖羊和草原型藏羊中處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P>0.05），在其余3個(gè)綿羊品種中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)。

表2 FSTL3 基因g.40674542C＞T 位點(diǎn)在不同綿羊品種中的群體遺傳學(xué)分析

2.2 FSTL3 基因g.40674542C>T 位點(diǎn)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系

從表3 可知，F(xiàn)STL3基因g.40674542C>T 位點(diǎn)不同基因型與小尾寒羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)之間均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（P>0.05）。

表3 FSTL3 基因g.40674542C＞T 位點(diǎn)各基因型小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù) 只

3 討論

卵泡抑素樣蛋白3（FSTL3）廣泛分布在哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)各個(gè)組織器官中，在胎盤中表達(dá)最高，其次是睪丸、胰腺和心臟。FSTL3基因?qū)儆赥GF-β 超家族，能夠與BMPs、肌生成抑制素和活化素等進(jìn)行特異性結(jié)合，使其近乎被全部裂解，無(wú)法與相應(yīng)受體結(jié)合［13-14］，抑制Smad 蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響TGF-β 超家族成員靶向調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［15］，進(jìn)而抑制TGF-β 的生物學(xué)功能。BMPs 家族中的許多成員參與調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)生及排卵［16］，并且BMP-Smad信號(hào)通路中的許多信號(hào)分子基因都與動(dòng)物繁殖相關(guān)，參與調(diào)控產(chǎn)羔數(shù)、排卵數(shù)等性狀［17］。研究表明，BMP4可以誘導(dǎo)原始生殖細(xì)胞（PGCs）的形成、增殖和定向遷移［18］，Smad1基因敲除小鼠表現(xiàn)為胚胎死亡，不產(chǎn)生或極少形成PGCs［19］，Smad5基因敲除小鼠表現(xiàn)與Smad1基因敲除小鼠相似［20］。由此可知，F(xiàn)STL3基因通過(guò)介導(dǎo)調(diào)控BMP-Smad 信號(hào)通路，進(jìn)而影響動(dòng)物排卵。FSTL3基因在動(dòng)物生殖調(diào)控上也有著重要的地位。研究表明，F(xiàn)STL3基因在卵巢儲(chǔ)備功能下降綜合癥患者的卵巢中表達(dá)量與正常相比顯著下降［21］，也可作為妊娠早期早發(fā)型先兆子癇的生物標(biāo)志物［22］，其敲除小鼠相比于正常小鼠表現(xiàn)為成年時(shí)睪丸增大和生殖細(xì)胞數(shù)量增加［23］，在FSTL3基因系統(tǒng)性過(guò)表達(dá)小鼠中，胰島素和胰高血糖素敏感性顯著增加［24］，在小鼠性腺軸中過(guò)表達(dá)FSTL3基因后，雄性小鼠性腺重量、精子數(shù)和生育力顯著降低，雌性小鼠產(chǎn)仔數(shù)顯著減少［25］。綜上所述，F(xiàn)STL3基因在動(dòng)物繁殖中的作用至關(guān)重要，但目前FSTL3基因?qū)τ诰d羊繁殖的影響鮮有報(bào)道，因此探索FSTL3基因?qū)τ诰d羊繁殖的影響尤為重要。

群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)STL3基因g.40674542C>T位點(diǎn)在6 個(gè)綿羊品種中均表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC<0.25），表明該位點(diǎn)在6 個(gè)綿羊品種中的遺傳多樣性相對(duì)貧乏，另外，F(xiàn)STL3基因g.40674542C>T 位點(diǎn)在灘羊、蘇尼特羊和策勒黑羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)，可能是因?yàn)樽匀贿x擇或人工選擇對(duì)該位點(diǎn)分布影響較大，也可能與選擇的綿羊品種數(shù)量較少有關(guān)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)STL3基因g.40674542C>T 位點(diǎn)CC 型各胎產(chǎn)羔數(shù)均高于TC 型，推測(cè)該位點(diǎn)突變?cè)谝欢ǔ潭壬辖档土诵∥埠虻漠a(chǎn)羔能力。

研究表明，突變能顯著改變動(dòng)物表型。1982 年Davis 等在澳大利亞布魯拉綿羊品種發(fā)現(xiàn)的FecB 突變，就是在BMPRIB基因的第746 位發(fā)生A>G 突變導(dǎo)致的，最終顯著提高了布魯拉綿羊的排卵數(shù)和產(chǎn)羔數(shù)［26］。本研究在FSTL3基因上發(fā)現(xiàn)1 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)g.40674542C>T，發(fā)生于第2 外顯子，沒有引起氨基酸的改變，屬于同義突變，同義突變不會(huì)造成對(duì)應(yīng)氨基酸的改變，但單核苷酸的替換會(huì)改變mRNA 的剪切效率或準(zhǔn)確性，從而影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平［27］，同義突變還可通過(guò)改變mRNA的構(gòu)象，從而降低mRNA 的穩(wěn)定性，影響多肽鏈的三維折疊及修飾加工的過(guò)程，進(jìn)一步改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能，最終對(duì)動(dòng)物表型產(chǎn)生影響［28］。因此，F(xiàn)STL3基因g.40674542C>T 位點(diǎn)可能對(duì)于綿羊產(chǎn)羔數(shù)有一定的影響。

4 結(jié)論

本研究篩選出綿羊FSTL3基因新的突變位點(diǎn)g.40674542C>T，其與小尾寒羊各胎次產(chǎn)羔數(shù)之間沒有顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05），F(xiàn)STL3基因g.40674542C>T 位點(diǎn)不適合用于小尾寒羊產(chǎn)羔性狀的選育。