梁敏華，楊震峰，蘇新國，宋春波

(1.廣東食品藥品職業(yè)學院 食品學院，廣州 510520；2.浙江萬里學院 生物與環(huán)境學院，浙江寧波 315100；3.華南農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，廣州 510640)

桃(PrunuspersicaL.)，原產(chǎn)于中國，為薔薇目薔薇科多年生大型木本植物，其果實色、香、味俱全，營養(yǎng)豐富。按照果實色澤分類，現(xiàn)在市場上的桃果實可分為白肉桃、紅肉桃和黃肉桃，其中黃肉桃果實中的主要色素成分為類胡蘿卜素[1]。類胡蘿卜素是一類天然植物色素的總稱，共軛雙鍵的分子結(jié)構(gòu)使得其在可見光條件下可呈黃、橙、紅3種顏色或以上3種顏色的混合色[2-3]。

番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopene β-cyclase，LCYb)是催化類胡蘿卜素中間產(chǎn)物番茄紅素向β-胡蘿卜素或其他含β環(huán)的類胡蘿卜素組分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵限速酶[4]。近年來，越來越多的研究表明隨著果實發(fā)育成熟進程的推進，果實中番茄紅素或含β環(huán)的類胡蘿卜素含量變化與LCYb基因的表達密切相關(guān)[5-7]。研究表明，成熟時期的黃肉桃果實，其類胡蘿卜素的主要組分為β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素和玉米黃素等[1, 8]。目前，有關(guān)桃果實中LCYb基因表達與β-胡蘿卜素和β-隱黃素等含β環(huán)類胡蘿卜素含量積累之間聯(lián)系的研究鮮有報道，桃果實中LCYb基因的分離和鑒定研究也尚未見報道。因此，本試驗以黃肉品種桃果實為試材，采用基因克隆技術(shù)從桃果實中獲得LCYb基因全長序列，通過實時熒光定量PCR分析其在果實不同發(fā)育階段的表達情況，為闡明其在桃果實類胡蘿卜素生物合成與積累過程的分子作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 產(chǎn)自浙江奉化的黃肉品種桃果實‘金麗’是本試驗主要材料。當果實發(fā)育處于盛花后35～45 d、55～65 d、95～105 d、105～120 d、120～150 d 5個階段，也就是果實分別發(fā)育至軟核期、硬核期、膨大期、硬熟期和完熟期時進行采樣，分別選取大小均勻、無蟲害及無機械損傷的果實進行試驗。

1.1.2 主要試劑 美國Omega公司的植物RNA提取試劑盒用于提取桃果實總RNA；北京康為世紀公司的反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成試劑盒用于合成反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA；日本TaKaRa公司的3′、5′-Full RACE cDNA試劑盒用于擴增目的基因3′、5′末端序列；美國Thermo公司的實時熒光定量PCR試劑盒用于檢測目的基因的表達情況。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成 桃果實果皮和果肉總RNA的提取采用Omega公司的植物RNA提取試劑盒并按說明操作。在提取總RNA的過程中，為防止總RNA中混雜的微量DNA對后續(xù)試驗的干擾，加入適量無Rnase活性的DNaseⅠ酶液。反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA的合成采用康為世紀公司的反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成試劑盒并按說明操作。

1.2.2 LCYb基因序列克隆與生物信息學分析 NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于搜索與桃果實LCYb氨基酸序列同源性較高的其他植物物種LCYb氨基酸序列。比對查找上述氨基酸序列的保守區(qū)域，并通過在線軟件(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)在上述保守區(qū)域設(shè)計簡并引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA為模板，采用簡并引物法PCR擴增LCYb基因中間核苷酸序列片段，PCR程序如下：94 ℃預變性2 min，然后進行33個循環(huán)(94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠分離、凝膠回收純化、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化及測序后得到基因的中間核苷酸序列片段。采用TaKaRa公司的3′、5′-Full RACE cDNA試劑盒，按照說明，以簡并引物法得到的LCYb基因核苷酸序列片段為模板分別設(shè)計LCYb基因3′、5′末端序列擴增特異性引物(表1)進行3′、5′末端序列PCR擴增。PCR產(chǎn)物同樣經(jīng)凝膠分離、凝膠回收純化、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化及測序后得到LCYb基因3′、5′末端核苷酸序列片段。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

注Note:*R=A/G；Y=C/T。

1.2.3 LCYb基因生物信息學分析 基因全長cDNA序列拼接采用DNAMAN5.2.2軟件?；蚓幋a區(qū)、編碼基因、蛋白性質(zhì)預測采用ExPASy在線軟件(http://web.expasy.org)。氨基酸序列比對分析采用NCBI數(shù)據(jù)庫及GeneDoc2.7.0軟件。蛋白亞細胞定位及二級結(jié)構(gòu)預測采用在線軟件Predictprotein(https://www.predictprotein.org)。蛋白三級結(jié)構(gòu)預測及展示采用SWISS-MODEL服務(wù)器(http://swissmodel.expasy.org)?；蛳到y(tǒng)進化樹分析采用MEGA 5.1 軟件。

1.2.4 實時熒光定量PCR 基因表達情況分析采用美國Thermo公司的實時熒光定量PCR試劑盒進行。按照試劑盒操作說明，以上述克隆所得LCYb基因全長核苷酸序列的編碼區(qū)序列為模板設(shè)計實時熒光定量PCR引物(表1)。分別加入1 μL cDNA、1 μL上游引物(100 μmol/L)、1 μL下游引物(100 μmol/L)、13 μL SYBR Green PCR混合液、9 μL DEPC水混合成25 μL PCR反應(yīng)體系。95 ℃預變性7 min，然后95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，重復上述步驟40次。以PpTEF2作為內(nèi)參基因[9]，每個反應(yīng)設(shè)置3次生物學重復，并進行陰性對照。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用2-ΔΔCT法對目的基因進行表達分析，不同批次及不同果實組織中基因的表達情況比較采用Duncan’s新復極差法進行顯著性分析(P≤0.05)，采用OriginPro 9.0軟件對試驗結(jié)果進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCYb基因的克隆與凝膠分析

通過簡并引物法得到的LCYb基因凝膠電泳條帶清晰，測序得到長度為606 bp的序列片段(圖1)。通過3′RACE擴增技術(shù)得到LCYb基因3′端PCR擴增產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶稍暗，經(jīng)后期純化富集測序仍能得到長度為706 bp的序列片段(圖1)。通過5′RACE擴增技術(shù)得到的LCYb基因3′端凝膠電泳條帶清晰，測序得到長度為1 027 bp的序列片段(圖1)。準確拼接上述3段序列得到桃果實LCYb基因的全長序列，長度為1 699 bp。通過調(diào)用NCBI數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有序列數(shù)據(jù)進行BLAST比對顯示，上述克隆獲得的LCYb基因全長序列與玫瑰LCYb基因(NCBI搜索號：KP768074)和草莓LCYb基因(NCBI搜索號：JN979375)全長序列同源性分別達88%和86%，因此將它命名為PpLCYb。具體克隆成果已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，搜索號為KJ789377。

M.100 bp DNA Marker；1.RT-PCR產(chǎn)物 The product of RT-PCR；2.3′RACE產(chǎn)物 The product of 3′RACE；3.5′RACE產(chǎn)物 The product of 5′RACE

2.2 LCYb基因生物學分析

2.2.1 基本理化性質(zhì)分析PpLCYb基因具有完整的基因編碼區(qū)，長度為1 515 bp，編碼504個氨基酸，呈酸性的天冬氨酸、谷氨酸個數(shù)為54個，呈堿性的精氨酸、賴氨酸個數(shù)為61個，等電點為8.76，呈弱堿性。所編碼的蛋白分子式為C2587H4011N689O719S25，分子質(zhì)量為57.1 ku，性質(zhì)不穩(wěn)定，脂溶指數(shù)85.32，親水指數(shù)-0.163，易溶于水。

2.2.2 氨基酸序列比對與功能結(jié)構(gòu)域分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫從其他植物物種中在線搜得到9條與PpLCYb基因編碼的氨基酸同源性較高的氨基酸序列。氨基酸序列比對及功能結(jié)構(gòu)域預測分析結(jié)果如圖2，在PpLCYb基因編碼的氨基酸序列上同樣存在著所有LCYb基因編碼的氨基酸序列所擁有的共同特征結(jié)構(gòu)域(第61～502位氨基酸)，這段特征結(jié)構(gòu)域?qū)儆赟DR超級家族。第89～453位氨基酸屬于番茄紅素環(huán)化酶蛋白特征編碼區(qū)，如LCYb和ε-環(huán)化酶等，其中第287～292位氨基酸存在著LCYb特征序列(LYAMPF)，第363～381位氨基酸為NAD(P)/FAD結(jié)合區(qū)。

2.2.3 基因系統(tǒng)進化樹分析 采用BLAST軟件將PpLCYb基因編碼的氨基酸序列與已在NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)表的其他植物物種LCYb氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果顯示(圖3)，PpLCYb與同屬薔薇目的草莓FaLCYb(gi|498663613)聚類于一個小分支內(nèi)，親緣性好，可信度高。

2.2.4 蛋白亞細胞定位與二、三級結(jié)構(gòu)分析 亞細胞定位預測顯示PpLCYb蛋白定位在葉綠體上，但可信度僅為67%，后期仍需做進一步的試驗分析驗證。二級構(gòu)件中α-螺旋元件占30.36%，無規(guī)則卷曲元件占58.93%，β-折疊元件占10.71%，其中無規(guī)則卷曲元件占主要比例，β-折疊元件占比較少，這與使用SWISS-MODEL服務(wù)器預測得到的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)結(jié)果基本吻合(圖4)。

2.3 PpLCYb基因在桃果實不同發(fā)育組織中的表達分析

由表1設(shè)計好的實時熒光定量PCR引物所引發(fā)的PCR擴增，擴增效率為95%，處于90%～110%合理范圍區(qū)間，擴增產(chǎn)物溶解曲線在溫度為84.5 ℃時出現(xiàn)溶解單峰，擴增特異性強，以上數(shù)據(jù)表明設(shè)計好的實時熒光定量PCR引物可用于桃果實PpLCYb基因表達情況分析。在桃果實整個發(fā)育期間，PpLCYb基因無論在果實果皮還是果肉中均有表達(圖5)。隨著桃果實發(fā)育進程的推進，PpLCYb基因在果實中的表達總體呈現(xiàn)上升的趨勢，并在果實處于硬熟期時達到較大值，隨后在完熟期略有下降，但在這個過程中，PpLCYb基因在果皮和果肉中的表達無顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果初步表明，PpLCYb基因的表達與果實發(fā)育成熟程度在果實發(fā)育前期(軟核期、硬核期、膨大期、硬熟期)是呈正相關(guān)的，PpLCYb基因可能誘導了桃果實的發(fā)育成熟。

a.蛋白功能結(jié)構(gòu)域預測 Protein functional domains prediction；b.基酸序列同源性比較 Homology comparison of putative amino acids’sequence

圖3 桃果實PpLCYb基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic trees of PpLCYb gene

圖4 桃果實PpLCYb蛋白的三維結(jié)構(gòu)預測Fig.4 The deduced three-dimensional structure of PpLCYb protein

相同字母表示在0.05水平上差異不顯著 The same letter means non-significant difference at 0.05 levels

3 討 論

目前，已從與桃果實同屬薔薇目薔薇科的草莓(Fragariaxananassa)(NCBI搜索號：JN979375)、枇杷(Eriobotryajaponica)(NCBI搜索號：JX089591)、歐李(Prunushumilis)(NCBI搜索號：KR866276)、蘋果(Malusdomestica)(NCBI搜索號：KU508827)等果實中分離出LCYb基因全長序列，它們長度普遍處于1 650～1 900 bp之間，編碼495～505個氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，植物中LCYb基因是一個大家族，不同物種中LCYb所編碼的氨基酸序列也有很大差異[10]，這種現(xiàn)象在本研究中也同樣存在，研究結(jié)果顯示不同植物物種LCYb所編碼的氨基酸序列N端差異性比較大(圖2)，這可能是不同植物進化的結(jié)果。但盡管如此，靠近序列C端依然存在幾個高度保守區(qū)域，如所有植物LCYb所固有的特征結(jié)構(gòu)域LYAMPF和NAD(P)/FAD結(jié)合區(qū)等，這些高度保守的結(jié)構(gòu)域被認為與酶的特異性催化功能密切相關(guān)[11-12]。本研究首次從桃果實中克隆得到PpLCYb基因全長序列，長度為1 699 bp，編碼504個氨基酸，氨基酸序列比對及功能結(jié)構(gòu)域預測分析顯示其上同樣存在著LCYb特征結(jié)構(gòu)域和NAD(P)/FAD結(jié)合域，這表明本研究的克隆分析結(jié)果客觀可信。

LCYb是控制類胡蘿卜素中間產(chǎn)物番茄紅素發(fā)生環(huán)化作用的重要限速酶，LCYb基因表達水平增高能加快β-胡蘿卜素或其他含有β環(huán)結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素的積累，LCYb基因表達水平降低則會導致番茄紅素的積累[13]。Ambrosio等[14]通過基因工程技術(shù)誘導番茄果實中LCYb基因進行超量表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果實中大量積累β-胡蘿卜素。紅肉品種柑橘發(fā)育過程中，果實果皮和果肉中LCYb基因的表達水平較低，這可能與果實中番茄紅素的大量積累有關(guān)[15-17]。Wisutiamonkul等[18]研究發(fā)現(xiàn)在25 ℃貯藏條件下，‘Chanee’榴蓮果實總類胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和玉米黃素的含量與果實中LCYb基因的表達呈顯著正相關(guān)。增強黃肉品種番木瓜中LCYb基因的表達，果實中番茄紅素含量一直保持較低的水平，而β-胡蘿卜素和β-隱黃素的含量則顯著增高，此外，抑制紅肉品種番木瓜中LCYb基因的表達，果實中番茄紅素含量持續(xù)增加，β-胡蘿卜素和β-隱黃素的含量則基本保持較低水平[19]。本試驗結(jié)果顯示，隨著桃果實發(fā)育成熟進程的推進，PpLCYb基因在果實中的表達逐漸增高并在果實發(fā)育處于硬核期時達到較大值，隨后在果實完熟期時略有下降。這表明PpLCYb基因的表達與果實發(fā)育成熟過程是基本上呈正相關(guān)的，PpLCYb基因可能參與到果實成熟過程中色澤品質(zhì)的調(diào)控環(huán)節(jié)，但具體分子作用機制有待進一步的試驗驗證。

4 結(jié) 論

本試驗首次從桃果實中成功克隆PpLCYb基因，生物信息學分析結(jié)果與其他物種已報道的LCYb基因信息基本一致，但上述預測分析結(jié)果有待進一步的試驗驗證。PpLCYb基因的表達與果實的成熟程度基本呈正相關(guān)，數(shù)據(jù)表明其可能參與到類胡蘿卜素生物合成的調(diào)控過程中。以上結(jié)果可為后續(xù)PpLCYb蛋白功能鑒定、結(jié)構(gòu)分析以及桃果實采后貯藏過程中類胡蘿卜素的合成調(diào)控等試驗研究提供一定的理論依據(jù)。