王韋華,劉桂梅,吳奇強,黃鵬波,白 鴿,王國超

(1.渭南職業(yè)技術(shù)學院,陜西渭南 714000； 2.渭南市動物疫病預防控制中心,陜西渭南 714000)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的急性、烈性、高度接觸性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織要求通報的動物疫病，中國將口蹄疫列為一類動物疫病的首位[1-2]。口蹄疫傳播迅速，宿主范圍廣，發(fā)病率高，易形成大規(guī)模流行，造成幼年動物死亡，使動物生產(chǎn)性能降低，對畜牧業(yè)的發(fā)展造成嚴重危害[3]。本病流行于世界各地，目前在非洲、亞洲和歐洲的疫情最嚴重[4-5]。動物感染FMDV后對幼畜心臟造成損害而導致死亡，引起成年奶牛奶產(chǎn)量下降、體質(zhì)量降低和畜力下降等，影響其生產(chǎn)性能。此外，奶牛、山羊和綿羊等動物感染FMDV，容易形成帶毒狀態(tài)，向外界長期排毒，甚至有的帶毒時間長達2～3 a，這也是FMD難以防范和根除的原因之一[6-7]。為了控制和消滅FMD，各國花費巨額開支來限制疫區(qū)或可疑疫區(qū)國家產(chǎn)品的出口或上市，給全球的動物或動物性產(chǎn)品的貿(mào)易帶來巨大影響。及時確定FMDV的感染對采取措施控制和消除口蹄疫至關(guān)重要，目前一般是現(xiàn)場采樣后進行實驗室檢測[8-9]。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)自發(fā)明以來引起各國科學家的關(guān)注，其操作方法、特異性、敏感性、擴增條件等方面均優(yōu)于其他核酸擴增技術(shù)，在動物疫病病原的檢測領(lǐng)域有著非常廣闊的應(yīng)用前景[10]。目前，LAMP在口蹄疫病原檢測方面有廣泛的應(yīng)用研究[11-12]。吳紹強等[13]根據(jù)滅活的口蹄疫亞洲Ⅰ型病毒基因組的3D區(qū)域設(shè)計3對引物，優(yōu)化體系中的成分、反應(yīng)條件和溫度，確定體系的敏感性和特異性，建立口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫核酸擴增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)檢測方法，為FMDV現(xiàn)場檢測提供一種簡便快速的解決方案。秦智鋒等[14]通過將RNA的反轉(zhuǎn)錄與LAMP技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)FMDV的3D基因設(shè)計3對特異性引物，建立FMDV的RT-LAMP檢測方法，僅需要75 min就可以完成RNA的提取和檢測，所建立的檢測方法靈敏，與實時熒光定量PCR靈敏度相當，而且簡單，不需要復雜的儀器，是適合基層和現(xiàn)場檢測的分子生物學檢測方法，使LAMP技術(shù)用于口蹄疫的檢測成為可能，具有很高的實用價值。李健等[15]根據(jù)口蹄疫病毒多聚蛋白基因保守區(qū)段設(shè)計RT-LAMP的特異性引物，探究RT-LAMP靈敏性和特異性，建立快速檢測FMDV的RT-LAMP方法，同時評價該方法的靈敏性和特異性，所建立的方法可檢測到10-5稀釋度的目標病毒核酸量，比普通RT-PCR的靈敏性高100倍，比熒光PCR高10倍。

LAMP不僅適用于實驗室檢測，也適用于條件較差的基層實驗室或者場區(qū)現(xiàn)場檢測。它不需要經(jīng)歷模板的高溫變性、不同溫度的長時間循環(huán)、復雜繁瑣的電泳和紫外觀測等過程，目的基因的擴增和檢測可以一步完成，擴增效率高[16-17]。具有不需要使用特殊的儀器設(shè)備、操作過程簡單、反應(yīng)時間短、有較高的靈敏度和特異性的優(yōu)點，而且對于結(jié)果的觀察和判定直觀，可以用肉眼直接觀察反應(yīng)液顏色的變化，迅速地對結(jié)果進行判定。

研究基于LAMP技術(shù)具有操作方便、快速靈敏的特點，本試驗建立FMDV可視化RT-LAMP的檢測方法，為口蹄疫的現(xiàn)場快速診斷提供一種可選用的方法。

1 材料與方法

1.1 疫苗、病毒

豬口蹄疫O型滅活疫苗(O/Mya98/XJ/2010株+O/GX/09-7株)，口蹄疫O型、亞洲Ⅰ型二價滅活疫苗(OHM/02株+JSL株)，口蹄疫O型、A型、亞洲Ⅰ型三價滅活疫苗(OHM/02株+AKT-III株+Asia/KZ/03株)均為天康生物股份有限公司產(chǎn)品；豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)全基因、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV) 和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的RNA，由西北農(nóng)林科技大學獸醫(yī)公共衛(wèi)生學科研平臺實驗室提供。

1.2 主要試劑

病毒總RNA/DNA的小量純化試劑盒、RNAiso Plus(9109)Trizol，購自大連寶生物工程有限公司；Bst DNA 聚合酶大片段、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、MgSO4(#B1003S)均購自New England BioLabs公司；10 000× SYBR GreenⅠ核酸染料購自Solarbio公司；Betaine購自天津格里斯醫(yī)藥化學技術(shù)有限公司；Quant One Step RT-PCR Kit(KR113)購自北京天跟生化技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)布的O、A、AsiaⅠ血清型豬FMDV的核苷酸序列，用生物軟件進行序列比對選擇其中高度保守的序列，根據(jù)北京蘭譜生物科技有限公司公布的LAMP引物設(shè)計網(wǎng)站設(shè)計兩對擴增引物，并交西安擎科澤西生物科技有限公司合成。查詢國家標準中發(fā)表的FMDV檢測引物序列進行合成。所用引物序列如表1所示。

表1 口蹄疫病毒RT-LAMP引物Table 1 RT-LAM P primers used for FMDV detection

1.4 疫苗中FMDV總RNA的提取

對豬口蹄疫油佐劑滅活疫苗采用3種處理方式，分別為直接用口蹄疫滅活疫苗、直接離心法、-20 ℃ 凍融離心法，分別按試劑盒法和Trizol法提取病毒總RNA。分析樣品處理方法對RNA提取量的影響。

1.5 建立口蹄疫病毒RT-LAMP反應(yīng)體系

口蹄疫病毒RT-LAMP的反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)體系包含：1.0 μL Bst DNA聚合酶(8 U/μL)、0.5 μL AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μL)、1.0 μL Betaine(5 μmol/μL)、3.5 μL dNTPs(10 mmol/L)、2.5 μL 10×Themopol Reaction Buffer、1.5 μL MgSO4(100 mmol/L)、0.5 μL 外引物F3/B3(10 pmol/μL)、4.0 μL內(nèi)引物FIP/BIP(10 pmol/μL)、2.0 μL RNA模板(陰性對照不加模板)，RNase-Free ddH2O補齊總體積。

RT-LAMP反應(yīng)在恒定條件下進行，對反應(yīng)時間和溫度進行優(yōu)化。

1.5.1 RT-PCR和RT-LAMP引物PCR鑒定 將合成的FMDV RT-PCR檢測引物和設(shè)計合成的RT-LAMP引物進行PCR擴增，取10 μL產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5.2 最適反應(yīng)溫度的確定 AMV反轉(zhuǎn)錄酶最適作用溫度為37～42 ℃，為確定最適反應(yīng)溫度，分別設(shè)置37 ℃ 30 min反轉(zhuǎn)錄，再63.5 ℃恒溫1 h；42 ℃ 30 min反轉(zhuǎn)錄，再63.5 ℃恒溫擴增1 h。

1.5.3 RT-LAMP反應(yīng)最佳引物濃度的確定 設(shè)置不同引物濃度組，一組為外引物F3和B3各0.25 μL，內(nèi)引物FIP和BIP各2 μL，即外引物濃度為0.10 pmol/μL，內(nèi)引物濃度為0.80 pmol/μL；另一組為外引物F3和B3各0.5 μL，內(nèi)引物FIP和BIP各4 μL。即外引物終濃度為0.20 pmol/μL，內(nèi)引物終濃度為1.60 pmol/μL。反應(yīng)條件按照“1.5.2”中確定的最佳條件進行。

1.6 RT-LAMP產(chǎn)物的鑒定和可視化觀察

1.6.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RT-LAMP產(chǎn)物有特異性的梯狀條帶，為了將各片段明顯區(qū)分開，可適當延長電泳時間。停止電泳后，放置于凝膠成像儀中在合適的波長條件下觀察。

1.6.2 RT-LAMP產(chǎn)物的可視化觀察 RT-LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)液中加入1 μL 的SYBR GreenⅠ染料，觀察反應(yīng)液是否有顏色變化，當反應(yīng)液為陽性時呈現(xiàn)明顯的綠色，陰性時呈淡橙色。肉眼觀察顏色變化后，在紫外燈下照射，觀察反應(yīng)管是否有熒光產(chǎn)生，陽性管可產(chǎn)生強烈的熒光，陰性不產(chǎn)生熒光。

1.7 口蹄疫病毒的RT-PCR檢測

按照Quant一步法RT-PCR試劑盒說明書進行檢測。反應(yīng)體系為25 μL，包括：2.5 μL 10× RT-PCR Buffer、1.0 μL 超純 dNTPs (10 mmol/L)、5.0 μL 5× RT-PCR Enhancer、0.25 μL RNasin(40 U/μL)、1.75 μL HotmasterTaq聚合酶(2.5 U/μL)、0.25 μL Quant RTase (一步法)、1.5 μL 引物FMDV-F(10 pmol/μL)、1.5 μL引物FMDV-R(10 pmol/μL)、2.0 μL RNA模板，RNase-Free ddH2O補齊總體積。

反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.8 RT-PCR產(chǎn)物的鑒定

取RT-PCR產(chǎn)物10 μL加入到加樣孔中，電泳30 min左右。取出凝膠放置于凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外燈照射下觀察結(jié)果，陽性在106 bp的位置出現(xiàn)條帶。

1.9 RT-LAMP敏感性試驗

將提取的FMDV模板利用核酸蛋白檢測儀測定陽性樣品其RNA濃度后，將其稀釋不同的倍數(shù)，按10倍倍比稀釋[18]，稀釋成11個稀釋度100～10-10，利用上文中的RT-LAMP方法和常規(guī)的RT-PCR方法同時檢測，比較兩種不同檢測方法的敏感性，兩者反應(yīng)后產(chǎn)物的檢測用瓊脂糖凝膠電泳方法，并在RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR Green Ⅰ核酸染料觀察熒光變化。

1.10 RT-LAMP方法特異性試驗

根據(jù)建立的RT-LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，分別加入FMDV、CSFV、PEDV、TGEV、PRRSV等RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ核酸燃料觀察熒光變化，以檢驗所建立RT-LAMP檢測方法的特異性[19]。

同時做FMDV、CSFV、PEDV、TGEV、PRRSV的RT-PCR檢測，按“1.7”中的RT-PCR反應(yīng)體系，根據(jù)以下程序進行RT-PCR擴增。

FMDV、PEDV反應(yīng)條件與“1.7”中相同。

CSFV、PRRSV反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s；35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

TGEV反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；53 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

反應(yīng)結(jié)束后，取RT-PCR產(chǎn)物10 μL做瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品處理方法和RNA提取方法的RNA提取量比較

以直接使用疫苗、直接離心法、-20 ℃凍融離心法3種方法處理，并比較提取RNA的試劑盒法和Trizol法，用核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度并進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果顯示，采用試劑盒法提取RNA時，-20 ℃凍融離心法處理的樣品RNA提取量較大；采用Trizol法提取疫苗中RNA時，直接從油佐劑疫苗中提取RNA的量最大。

比較試劑盒法和Trizol法，結(jié)果顯示在直接使用油佐劑疫苗樣品時，Trizol提取RNA的量最大。在-20 ℃凍融離心法處理樣品時，試劑盒法提取RNA的量較大。

2.2 口蹄疫病毒RT-LAMP反應(yīng)體系

2.2.1 RT-PCR引物和RT-LAMP引物鑒定 將FMDV RT-PCR檢測引物和RT-LAMP引物進行PCR鑒定，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，F(xiàn)MDV RT-PCR檢測引物和RT-LAMP引物加入陽性模板的都擴增出與預期理論值相符的片段。FMDV RT-PCR檢測引物擴增片段為106 bp左右，RT-LAMP引物擴增片段為200 bp左右，表明設(shè)計合成的RT-PCR檢測引物和RT-LAMP引物均可以對FMDV基因進行擴增。

1.RT-PCR檢測引物陰性對照 Negative control with RT-PCR detection；2.RT-PCR檢測引物陽性 Positive with RT-PCR detectionr；M.DNA Marker DL500；3.RT-LAMP引物陽性 Positive with RT-LAMP detcection；4.RT-LAMP引物陰性對照 Negative control with RT-LAMP detection

2.2.2 溫度對AMV反轉(zhuǎn)錄酶的影響 溫度依次設(shè)置3組，反應(yīng)結(jié)束后各取出10 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，3組反應(yīng)溫度差距不大，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶直接在63.5 ℃恒溫擴增1 h 對結(jié)果無影響，因此將最佳反應(yīng)溫度和時間設(shè)定為63.5 ℃恒溫擴增1 h。

2.2.3 RT-LAMP反應(yīng)引物濃度的優(yōu)化 引物濃度設(shè)置兩組，反應(yīng)結(jié)束后各取出10 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，第2組比第1組的條帶更加明顯和清晰，即RT-LAMP反應(yīng)體系外引物F3和B3各0.5 μL，內(nèi)引物FIP和BIP各4 μL，即外引物濃度為0.20 pmol/μL、內(nèi)引物濃度為1.60 pmol/μL 時更適宜。

M.DNA Marker DL500；1.37 ℃ 30 min 63.5 ℃ 1 h；2. 42 ℃ 30 min 63.5 ℃ 1 h；3.63.5 ℃ 1 h

M.DNA Marker DL500；1.F3/B3 0.25 μL、FIP/BIP 2 μL；2.F3/B3 0.5 μL、FIP/BIP 4 μL

2.3 口蹄疫病毒RT-LAMP產(chǎn)物的觀察

根據(jù)上述已優(yōu)化的反應(yīng)體系，進行RT-LAMP反應(yīng)，結(jié)束后各取出10 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖4。再在反應(yīng)管和陰性對照管中分別加入1 μL SYBR GreenⅠ核酸染料，觀察到陽性管呈現(xiàn)明顯的黃綠色，陰性對照為淡橙色(圖5-A)。在紫外燈下觀察到陽性管中能發(fā)出熒光，而陰性對照不能(圖5-B)。

2.4 RT-LAMP方法敏感性

反應(yīng)結(jié)束后RT-LAMP反應(yīng)和RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物各取出10 μL置于瓊脂糖凝膠電泳中檢測，電泳結(jié)果見圖6和圖7。由圖6可以看出，RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物隨著RNA濃度的降低，條帶亮度先變亮到達最適濃度后，條帶亮度逐漸減弱，檢測到模板RNA最低稀釋度為10-9。由圖7可以看出，RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物隨著RNA濃度的降低條帶亮度都在逐漸減弱，檢測到模板RNA最低稀釋度為10-8。

RT-LAMP檢測方法和RT-PCR檢測方法檢測模板RNA的最低稀釋度分別是10-9和為10-8，表明RT-LAMP檢測方法比RT-PCR檢測方法更靈敏。

M.DNA Marker DL10 000；1～2.陽性對照 Positive control；3.陰性對照 Negative control

1～2.陽性對照 Positive control；3.陰性對照 Negative control

M.DNA Marker DL2000；1～11.RNA稀釋度100～10-10倍 RNA dilution ratio of 100～10-10；12.陰性對照 Negative control

M.DNA Marker DL2000；1～11.代表RNA稀釋度100～10-10倍 RNA dilution ratio of 100～10-10；12.陰性對照 Negative control

2.5 RT-LAMP方法特異性結(jié)果

用所建立的RT-LAMP方法分別檢測FMDV、CSFV、PEDV、TGEV、和PRRSV的RNA，取10 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖8，僅看到FMDV樣品出現(xiàn)明顯的梯狀條帶，其余樣品均沒有條帶出現(xiàn)。

同時設(shè)立這5種病毒的RT-PCR對照鑒定，結(jié)果見圖9，可以看到FMDV樣品在100 bp的位置出現(xiàn)條帶，CSFV在140 bp位置出現(xiàn)條帶，PEDV在672 bp的位置出現(xiàn)條帶，TGEV在276 bp的位置出現(xiàn)條帶，PRRSV出現(xiàn)高致病性的條帶在400 bp的位置，經(jīng)RT-PCR鑒定每種病毒均出現(xiàn)特異性條帶，證明5種病毒均為陽性。結(jié)合兩者結(jié)果，說明所建立RT-LAMP方法具有良好的特異性。

M.DNA Marker DL2000；1.FMDV；2.CSFV；3.PEDV；4.TGEV；5.PRRSV；6.陰性對照 Negative control

1.FMDV；2.CSFV；3.PEDV；4.TGEV；5.PRRSV；M1.DNA Marker DL2000；M2.DNA Marker DL500

3 討 論

根據(jù)不同的反應(yīng)條件，可以將核酸擴增技術(shù)分為兩類：非恒溫擴增技術(shù)和恒溫擴增技術(shù)，其代表方法分別是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)[20-21]。PCR技術(shù)是20世紀80年代發(fā)明的核酸擴增技術(shù)，已成為重要的分子生物學研究方法，得到廣泛的應(yīng)用。LAMP是2000年由日本科學家發(fā)明的核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)具有操作簡單、反應(yīng)條件簡單、快速、靈敏度高等優(yōu)點，不僅適用于實驗室檢測，也適用于條件較差的基層實驗室或者場區(qū)現(xiàn)場檢測。該技術(shù)自發(fā)明以來引起各國科學家的關(guān)注，對其進行更深的研究及應(yīng)用條件的探索，在病原微生物檢測、動物胚胎性別區(qū)分、轉(zhuǎn)基因食品檢測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[22-23]，具有良好前景。

本試驗是基于LAMP技術(shù)的操作方便、快速靈敏的特點，建立口蹄疫病毒可視化RT-LAMP的檢測方法，為口蹄疫的現(xiàn)場快速診斷提供一種更加簡便的方法。與吳紹強等[13]建立的口蹄疫病毒亞洲Ⅰ型的RT-LAMP檢測方法不同，本研究建立口蹄疫病毒O型、A型、亞洲Ⅰ型3種血清型的通用檢測，并與一步法的RT-PCR進行敏感性比較，所建立的RT-LAMP方法檢測到模板RNA最低稀釋度為10-9，比RT-PCR方法靈敏10倍。

秦智鋒等[14]、李健等[15]建立FMDV不同血清型的RT-LAMP檢測方法，可以在短時間內(nèi)完成RNA的提取和檢測，均采用試劑盒法抽提核酸，其中秦智鋒等采用EZ1 Virus Mini Kit V2.0抽提試劑盒，由儀器自動完成核酸抽提，所需的成本較高。趙毅等[24]在口蹄疫疫苗種毒、滅活病毒液和白油乳化滅活疫苗病毒中提取病毒RNA，建立口蹄疫病毒滅活疫苗中VP1基因RNA抽提方法。對從白油乳化滅活疫苗病毒提取的RNA進行探究，采用6種方法離心，即直接離心法、-20 ℃凍融離心法、1∶1加酒精凍融離心法、1∶2加酒精凍融離心法、1∶3加酒精凍融離心、加滅菌水混合后離心法。研究發(fā)現(xiàn)加入酒精凍融取下層清液效果最佳。在這些研究的基礎(chǔ)上，本研究探究口蹄疫滅活疫苗中RNA的提取方式的不同對RNA提取量的影響，確定采用試劑盒法提取RNA時，-20 ℃凍融離心法處理的樣品提取RNA量較大；采用Trizol法提取疫苗中RNA時，油佐劑疫苗直接提取法不需要經(jīng)過反復凍融再離心取下清等繁瑣步驟來處理，簡化試驗步驟，節(jié)省了時間，所測定的RNA濃度較高、效果最好。同時，對所建立的RT-LAMP體系進行優(yōu)化，在最佳的反應(yīng)條件和最佳的外、內(nèi)引物濃度下，電泳后跑出來的特異性梯狀條帶更加清晰和明顯。還進行了敏感性和特異性試驗，確定與普通RT-PCR檢測相比RT-LAMP方法具有更高的靈敏度和特異性。通過這些試驗確定所建立的可視化RT-LAMP檢測方法是一種特異性強、敏感性高、快速檢測FMDV的方法。

由于RT-LAMP方法具有較高的敏感性，檢測到模板RNA最低稀釋度為10-9，而且RT-LAMP方法擴增出的產(chǎn)物量極大，操作過程如果不規(guī)范，在開蓋檢測產(chǎn)物的過程中可能散布到環(huán)境中，形成氣溶膠，殘留在設(shè)備上，通過氣溶膠和用具的污染可以引起假陽性的發(fā)生，所以操作一定要嚴格按照規(guī)定進行，注意消毒，防止氣溶膠的污染[25]。

由于口蹄疫是一種急性傳染病，具有高度接觸傳染性，是世界動物衛(wèi)生組織要求通報的動物疫病，對口蹄疫有嚴格的生物安全管理規(guī)定，分離口蹄疫病毒必須在有資質(zhì)的實驗室進行[26]，因此，常規(guī)的實驗室對病原學的檢測只能是對疑似病料的分子生物學檢測，不能進行相關(guān)的臨床檢測。所以選擇滅活疫苗為材料提取病毒的核酸。所建立方法的臨床檢測還需要在有資質(zhì)的實驗室與生產(chǎn)實踐中進一步確認和驗證。