曹發(fā)昊，張百勝，王艷萍，歐陽(yáng)五慶

(1. 運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西運(yùn)城 044000；2.鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，鄭州 450044；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

人參(PanaxginsengC. A. Mey)是一種藥食兩用的藥用植物，具有抗腫瘤、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力及抗衰老等功效[1-2]，人參皂苷(Ginsenoside，GS)是其發(fā)揮功效的重要成分之一，皂苷是一種很好的免疫調(diào)節(jié)劑，可用于防治人類(lèi)或動(dòng)物疾病[3-4]。納米乳(Nanoemulsion，NE)是油和水在表面活性劑和(或)助表面活性劑作用下形成的一種穩(wěn)定透明的膠體分散系，具有藥物載體的多種優(yōu)勢(shì)[5]。人參皂苷具有表面活性劑的性質(zhì)，能和某些成分作用形成粒徑10～100 nm的納米乳，筆者前期用人參皂苷和鹽酸左旋咪唑(Levamisole Hydrochloride，LH)成功制備粒徑23.08 nm的復(fù)方人參皂苷納米乳，并對(duì)其急性毒性進(jìn)行研究[6]。為了研究口服復(fù)方人參皂苷納米乳對(duì)抗原免疫效果的影響，本研究給小鼠皮下注射卵清白蛋白(OVA)抗原 2 次，在首次和第 2 次注射前連續(xù)灌胃給予相應(yīng)藥物，通過(guò)檢測(cè)血清抗體水平、脾細(xì)胞因子水平和脾淋巴細(xì)胞增殖能力，確定復(fù)方人參皂苷納米乳對(duì)OVA免疫效果的影響，為復(fù)方人參皂苷納米乳免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑 人參皂苷(陜西浩洋生物科技有限公司)，鹽酸左旋咪唑(山東弘揚(yáng)獸藥原料有限公司)，卵清白蛋白OVA(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司)，MTS試劑盒(艾美捷科技有限公司)，TMB顯色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG1(上海羽朵生物科技有限公司)，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG2a抗體(上海北諾生物科技有限公司)，IL-4 ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)，IFN-γ ELISA試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)。

空白納米乳組成：表面活性劑Solutol○RHS-15占25.33%，聚乙二醇400占2.53%，甘油占10.14%，肉豆蔻酸異丙酯占2.53%，蒸餾水占56%。

復(fù)方人參皂苷納米乳組成：空白納米乳中加入人參皂苷和鹽酸左旋咪唑，使其質(zhì)量濃度分別為30.15和30.04 mg·mL-1。

鹽酸左旋咪唑納米乳：空白納米乳中加入鹽酸左旋咪唑，使其終質(zhì)量濃度為30.04 mg·mL-1。

人參皂苷納米乳：空白納米乳中加入人參皂苷，使其終質(zhì)量濃度為30.15 mg·mL-1。

人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液：蒸餾水中加入人參皂苷和鹽酸左旋咪唑，使其終質(zhì)量濃度分別為30.15和30.04 mg·mL-1。

1.1.2 儀器 雷磁 PHS-25 數(shù)顯酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，HORIBA SZ-100納米粒度/Zeta電位分析儀(上海巨納科技有限公司)，DNM-9606酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)，倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器一廠(chǎng))，ZWC-08磁力攪拌器(金壇市鴻科儀器廠(chǎng))。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 成年Balb/c小鼠，體質(zhì)量為22～25 g，購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方 法

1.2.1 復(fù)方人參皂苷納米乳的制備 按照文獻(xiàn)[6]確定的復(fù)方人參皂苷納米乳配方，先將人參皂苷、表面活性劑和助表面活性劑于磁力攪拌器中(450 r·min-1，25 ℃)混合均勻，然后加入油相繼續(xù)攪拌混勻，最后緩慢滴加溶解鹽酸左旋咪唑的蒸餾水，攪拌直至形成黃色澄清的復(fù)方人參皂苷納米乳。

1.2.2 小鼠分組與給藥 小鼠90只，分為9組，每組10只，雌雄各半。具體分組如下：正常對(duì)照組(給予生理鹽水)、OVA對(duì)照組(給予生理鹽水)、空白納米乳組(給予空白納米乳)、鹽酸左旋咪唑納米乳組(給予25 mg·kg-1鹽酸左旋咪唑納米乳)、人參皂苷納米乳組(給予25 mg·kg-1人參皂苷納米乳)、人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組(給予50 mg·kg-1人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液)、復(fù)方人參皂苷納米乳高、中、低劑量組(分別給予100、50、25 mg·kg-1復(fù)方人參皂苷納米乳)。其中人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液和復(fù)方人參皂苷納米乳中人參皂苷和鹽酸左旋咪唑質(zhì)量比為1∶1。

小鼠(除正常對(duì)照組外)皮下注射OVA抗原100 μg，注射 2 次，間隔2 周，每只小鼠分別于首次和第 2 次注射前3 d連續(xù)灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，灌胃量均為0.4 mL。第 2 次注射后14 d，采集全血和脾臟組織，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 血清抗體水平測(cè)定 參照試劑盒說(shuō)明，采用間接ELISA法測(cè)定IgG、IgG1和IgG2a血清抗體水平[7]。

1.2.4 脾細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4測(cè)定 無(wú)菌條件下，脾臟處理后用培養(yǎng)液制備5×106mL-1脾細(xì)胞懸液。96孔板中每孔加入100 μL脾細(xì)胞懸液，再加入OVA抗原(終質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1)，培養(yǎng)48 h后，取上清，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)IL-4和IFN-γ水平。

1.2.5 脾淋巴細(xì)胞增殖能力測(cè)定 96孔板中加入5×106mL-1脾細(xì)胞懸液(每孔100 μL)，再加入100 μL培養(yǎng)液，加入OVA使其終質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1。設(shè)空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)液)、陰性對(duì)照組(加細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加OVA)，培養(yǎng)44 h 后加入MTS，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后酶標(biāo)儀測(cè)定OD490值，計(jì)算增殖刺激指數(shù)SI。

SI=加抗原培養(yǎng)物OD490/不加抗原培養(yǎng)物OD490

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方人參皂苷納米乳對(duì)小鼠血清IgG抗體水平的影響

由表1可知，空白納米乳組IgG抗體水平與OVA對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。復(fù)方人參皂苷納米乳中劑量組極顯著高于鹽酸左旋咪唑納米乳組(P<0.01)，顯著高于復(fù)方人參皂苷納米乳低劑量組(P<0.05)，與人參皂苷納米乳組、復(fù)方人參皂苷納米乳高劑量組和人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組差異不顯著(P>0.05)。

2.2 復(fù)方人參皂苷納米乳對(duì)小鼠IgG1和IgG2a血清抗體水平的影響

由表1可知，空白納米乳組IgG1和IgG2a抗體水平與OVA對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。復(fù)方人參皂苷納米乳中劑量組IgG1抗體水平極顯著高于鹽酸左旋咪唑納米乳組(P<0.01)，顯著高于復(fù)方人參皂苷納米乳低劑量組(P<0.05)，與人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組、人參皂苷納米乳組和復(fù)方人參皂苷納米乳高劑量組差異不顯著(P>0.05)。復(fù)方人參皂苷納米乳中劑量組IgG2a抗體水平顯著高于復(fù)方人參皂苷納米乳高劑量組、人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組和復(fù)方人參皂苷納米乳低劑量組(P<0.05)，極顯著高于鹽酸左旋咪唑納米乳組和人參皂苷納米乳組(P<0.01)。

2.3 復(fù)方人參皂苷納米乳對(duì)OVA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表2可知，空白納米乳組SI值與OVA對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。復(fù)方人參皂苷納米乳中劑量組SI值顯著大于人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組和復(fù)方人參皂苷納米乳高劑量組(P<0.05)，極顯著大于人參皂苷納米乳組、復(fù)方人參皂苷納米乳低劑量組和鹽酸左旋咪唑納米乳組(P<0.01)。

表1 OVA接種小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a抗體水平Table 1 Level of serum antibodies IgG, IgG1, IgG2a in OVA-inoculated mice

注：與OVA對(duì)照組比較， a和A分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。與復(fù)方人參皂苷納米乳中劑量組比較， b和B分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。下同。

Note: Compared with OVA control group, the shoulder characters a and A mean significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively. Compared with GS-LH-NE medium dosage group, the shoulder characters b and B mean significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively.Date are “average±standard deviation”.The same below.

表2 OVA接種小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)Table 2 Proliferation stimulating index of splenic lymphocytes in OVA-inoculated mice

2.4 復(fù)方人參皂苷納米乳對(duì)小鼠脾細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ水平的影響

由表3可知，空白納米乳組IL-4和IFN-γ水平與OVA對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。復(fù)方人參皂苷納米乳中劑量組IL-4水平顯著高于復(fù)方人參皂苷納米乳低劑量組(P<0.05)，極顯著高于鹽酸左旋咪唑納米乳組(P<0.01)，與復(fù)方人參皂苷納米乳高劑量組、人參皂苷納米乳組及人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組差異不顯著(P>0.05)。復(fù)方人參皂苷納米乳中劑量組IFN-γ水平顯著高于人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組、復(fù)方人參皂苷納米乳高劑量組和復(fù)方人參皂苷納米乳低劑量組(P<0.05)，極顯著高于人參皂苷納米乳組和鹽酸左旋咪唑納米乳組(P<0.01)。

3 討 論

疫苗在機(jī)體抵御疾病方面發(fā)揮重要作用，有些疫苗單獨(dú)使用就能達(dá)到目的，但有些疫苗的免疫原性弱，需要佐劑或免疫增強(qiáng)劑來(lái)改善疫苗的免疫原性，佐劑或免疫增強(qiáng)劑可以通過(guò)注射、口服或黏膜等多途徑給藥。Zhai等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在雞接種ND活疫苗前，口服劑量為5 g·kg-1人參莖葉皂苷溶液能顯著提高ND活疫苗免疫雞的血清HI抗體滴度、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和IgA+ B細(xì)胞數(shù)量。Yu等[9]發(fā)現(xiàn)在接種ND疫苗和禽流感疫苗前，口服人參莖葉皂苷能恢復(fù)環(huán)磷酰胺免疫抑制雞ConA和LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖能力，增加腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和IgA+ B細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)特異性抗體產(chǎn)生。在一些免疫試驗(yàn)中，常用小鼠、豚鼠、家兔作為動(dòng)物模型，OVA作為模式抗原，來(lái)研究機(jī)體的免疫功能[10]。本研究用小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，皮下注射OVA抗原，灌胃復(fù)方人參皂苷納米乳，研究口服復(fù)方人參皂苷納米乳對(duì)OVA免疫效果的影響。IFN-γ、IgG2a和 IL-4、IgG1分別反映Th1和Th2的免疫功能，Th1免疫主要由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，Th2免疫主要由Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，故通過(guò)測(cè)定IFN-γ、IgG2a、IL-4和IgG1這 4 個(gè)指標(biāo)可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能[11-13]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，口服復(fù)方人參皂苷納米乳中劑量組IL-4、IgG和IgG1水平顯著或極顯著高于復(fù)方人參皂苷納米乳低劑量組和鹽酸左旋咪唑納米乳組，IFN-γ、IgG2a和OVA誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖刺激指數(shù)顯著或極顯著高于人參皂苷納米乳組、人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液組、鹽酸左旋咪唑納米乳組及復(fù)方人參皂苷納米乳高劑量組和低劑量組?？诜?fù)方人參皂苷納米乳能增強(qiáng)OVA誘導(dǎo)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，產(chǎn)生Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)，其中中劑量(50 mg·kg-1)作用較強(qiáng)。復(fù)方人參皂苷納米乳口服增強(qiáng)免疫效果優(yōu)于人參皂苷-鹽酸左旋咪唑水溶液，這可能是由于：鹽酸左旋咪唑存在于水相中，而人參皂苷具有表面活性劑的性質(zhì)，能起到類(lèi)似表面活性劑Solutol○RHS-15作用，參與形成納米乳液滴界面膜，實(shí)現(xiàn)其納米化和藥物儲(chǔ)存庫(kù)的功效[14]；復(fù)方人參皂苷納米乳平均粒徑為23.08 nm，粒徑小、表面積大，且其zeta電位(-31.6 mV)小于0，有利于液滴和細(xì)胞相互作用，改善藥物的吸收和分布[15]?？诜?fù)方人參皂苷納米乳對(duì)小鼠非特異性免疫功能的影響有待后續(xù)研究。

表3 OVA接種小鼠脾細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ質(zhì)量濃度Table 3 Level of splenocyte cytokines IL-4 and IFN-γ in OVA-inoculated mice

4 結(jié) 論

口服復(fù)方人參皂苷納米乳能誘導(dǎo)OVA免疫小鼠產(chǎn)生Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)，表明人參皂苷和鹽酸左旋咪唑能協(xié)同增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，該結(jié)果為開(kāi)發(fā)復(fù)方人參皂苷納米乳免疫增強(qiáng)劑提供依據(jù)。