丁樹慧，齊曼婷，齊 斌*，張 晶*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.常熟理工學院生物與食品工程學院，蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，江蘇 常熟 215500；3.譜尼測試集團江蘇有限公司，江蘇 蘇州 215000）

近年來，隨著生活節(jié)奏的加快和工作壓力的增加，越來越多的人出現(xiàn)生理或心理疲勞，其形勢不可小覷。因此，提高身體機能、促進疲勞恢復(fù)成為運動醫(yī)學和軍事醫(yī)學爭相研究的課題[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，自由基的大量產(chǎn)生是引起疲勞的重要原因[3]。劇烈運動能引起機體氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，自由基堆積，氧化應(yīng)激增強，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。當體內(nèi)ROS含量過高時，機體免疫力下降，代謝水平失調(diào)，引起組織損傷和疲勞[4-6]。天然膳食多肽因其被人體吸收快、能迅速補充體內(nèi)蛋白質(zhì)損耗、延緩或促進疲勞恢復(fù)的特性引起研究者廣泛關(guān)注。Ren Jiaoyan等[7]用草魚蛋白質(zhì)和多肽灌胃小鼠，結(jié)果顯示，草魚多肽在延長小鼠力竭游泳時間、提高肝糖原和肌糖原含量、減少體內(nèi)乳酸及血清尿素氮水平等方面效果顯著，提高了小鼠抗氧化防御機能，具有緩解疲勞的作用。You Lijun等[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)木瓜蛋白酶水解得到的泥鰍多肽具有體外抗氧化能力，實驗動物體內(nèi)抗氧化酶系和乳酸脫氫酶的活力明顯提高，肝糖原的儲存量增加，具有抗疲勞能力。

低值海洋魚類價格低廉、蛋白質(zhì)含量高、氨基酸平衡，是完美的營養(yǎng)物質(zhì)來源。因此，本實驗研究了由堿性和中性蛋白酶分步酶解制得的低值海洋魚低聚肽的體外抗氧化活性及體內(nèi)抗疲勞作用。以谷胱甘肽為對照物，通過測定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力以及還原力評價體外抗氧化活性。體內(nèi)抗疲勞實驗中，小鼠灌胃低值海洋魚低聚肽4 周，記錄力竭游泳時間，并測定與疲勞相關(guān)的生理生化指標，探討低值海洋魚低聚肽的抗疲勞活性，為低值海洋魚的進一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

昆明種雄性小鼠（SPF級），體質(zhì)量18～22 g，由南通大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（蘇）2015-0016。

脫脂海洋魚粉（以鳀魚為主的海產(chǎn)小雜魚脫脂魚粉）中海海洋科技有限公司；堿性蛋白酶和中性蛋白酶諾維信生物技術(shù)有限公司；西洋參粉 吉林集安市春及參茸有限公司；2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azodiisobutyramidine dihydrochloride，AAPH）、DPPH 美國Sigma公司；pBR322質(zhì)粒 賽默飛世爾科技有限公司；乳酸試劑盒、尿素氮試劑盒、肝糖原試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純，購于上海國藥集團。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器公司；FA604A電子天平 上海精天電子儀器廠；UV-2450紫外-可見分光光度計、CTO-20AC高效液相色譜儀 日本島津公司；Legend Micro高速臺式離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀、xMark全波長酶標儀美國Bio-Rad公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；L-8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 低值海洋魚低聚肽的制備

稱取脫脂魚粉300 g，按照料液比1∶10加入去離子水，總加酶量2 500 U/g，pH 8時堿性蛋白酶酶解2 h，pH 7時中性蛋白酶酶解3 h，酶解溫度50 ℃，經(jīng)滅菌、離心過濾、冷凍干燥工藝制得低值海洋魚低聚肽。

1.3.2 低值海洋魚低聚肽氨基酸組成的測定

樣品經(jīng)6 mol/L HCl溶液水解22 h后，用氨基酸自動分析儀分析低值海洋魚低聚肽氨基酸組成和質(zhì)量分數(shù)。

1.3.3 低值海洋魚低聚肽的分子質(zhì)量及分布

采用凝膠過濾色譜法分析低值海洋魚低聚肽分子質(zhì)量分布[9]。色譜條件：色譜柱為TSKgel G2000SWXL（300 mm×7.8 mm，5 μm）；流動相為乙腈-超純水-三氟乙酸（體積比45∶55∶0.1）；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長220 nm。選用細胞色素c（分子質(zhì)量12 400 Da）、抑肽酶（分子質(zhì)量6 512 Da）、桿菌肽（分子質(zhì)量1 450 Da）、甘氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸（分子質(zhì)量451 Da）和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（分子質(zhì)量189 Da）為標準品。

1.3.4 體外抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除活性測定參照文獻[10-11]：100 μL待測液與100 μL DPPH（體積分數(shù)95%乙醇溶液配制）溶液均勻混合，于黑暗處反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測吸光度（A1）。100 μL DPPH溶液與100 μL去離子水反應(yīng)為對照組（A2），100 μL體積分數(shù)95%乙醇溶液與100 μL去離子水反應(yīng)為空白組（A0）。以谷胱甘肽（glutathione，GSH）為陽性對照，DPPH自由基清除率計算公式如下。

超氧陰離子自由基、羥自由基清除能力和還原力則分別采用鄰苯三酚自氧化法[12]、水楊酸法[13]和鐵氰化鉀法[14]測定，計算相應(yīng)的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），綜合評價低值海洋魚低聚肽的抗氧化活性。

1.3.5 低值海洋魚低聚肽對AAPH誘導(dǎo)pBR322氧化損傷的影響

參考Harsha等[15]的研究方法，測定低值海洋魚低聚肽對DNA氧化損傷的保護能力。對pBR322 DNA加入AAPH造成氧化損傷后，加入不同質(zhì)量濃度的低值海洋魚低聚肽于37 ℃孵育60 min，以VC為陽性對照，上樣進行瓊脂糖凝膠電泳，30 min后在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.3.6 低值海洋魚低聚肽的抗疲勞功效

1.3.6.1 動物實驗條件及分組

將72 只昆明種雄性小鼠分籠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，日光燈明暗交替12 h，期間自由飲食和飲水，室溫（20±2）℃，相對濕度（50±5）%。

取狀態(tài)良好的健康小鼠，稱體質(zhì)量并隨機分為5 組：空白組，陽性對照組（西洋參），低、中、高劑量組，每組12 只。低值海洋魚低聚肽和西洋參粉在灌胃前配制成水溶液，低、中、高劑量組分別灌胃0.5、2.0、3.5 mg/（g·d mb）低值海洋魚低聚肽，陽性對照組灌胃0.6 mg/（g·d mb）西洋參，空白組灌胃等體積的蒸餾水，每天早上9：00至10：00按劑量連續(xù)灌胃給藥4 周。每次灌胃前稱小鼠體質(zhì)量1 次，并觀察小鼠的行為特征。

1.3.6.2 力竭游泳實驗

末次灌胃30 min后，在小鼠尾根部負荷5%體質(zhì)量的鉛絲，放于水深約40 cm、水溫（25±1）℃的游泳箱中游泳。在實驗過程中小鼠四肢應(yīng)時刻保持運動，若小鼠漂浮不動，立即攪動附近水流迫使其不停運動。用秒表記錄小鼠從游泳開始至鼻孔完全沒入水中7 s無法浮出水面的時間作為小鼠力竭游泳時間[16]。

1.3.6.3 疲勞相關(guān)生化指標測定

末次灌胃30 min后，眼球取血，離心取上清液備用。將采血后的小鼠立即處死，取出肝臟，經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，保存?zhèn)溆?。按照試劑盒提供的方法測定乳酸、尿素氮、肝糖原含量及CAT、SOD和GSH-Px的活力[17-18]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗所有數(shù)據(jù)平行測定3 次，結(jié)果采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學處理，將不同劑量實驗組分別和對照組進行獨立樣本t檢驗，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異，采用Excel 2007軟件計算平均值及標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 低值海洋魚低聚肽氨基酸組成

氨基酸結(jié)構(gòu)組成與其生物活性密切相關(guān)。人們普遍認為具有抗氧化功能的氨基酸有亮氨酸、賴氨酸、谷氨酸、纈氨酸及丙氨酸[19-21]，丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸的含量在運動耐力測試中會迅速減少[22]。

表1 低值海洋魚低聚肽氨基酸組成Table1 Amino acid composition of the oliogopeptide

如表1所示，低值海洋魚低聚肽中亮氨酸等上述5 種氨基酸質(zhì)量分數(shù)為（40.74±0.45）%，丙氨酸等上述7 種氨基酸質(zhì)量分數(shù)約（29.64±0.48）%，提示其攝入后能夠提高運動能力。研究發(fā)現(xiàn)，在運動過程中谷氨酸能發(fā)揮積極作用，天冬氨酸有助于氧化脫氨、降低血液氨濃度，從而延緩疲勞的發(fā)生[23-26]。低值海洋魚低聚肽含有（14.08±0.02）%谷氨酸和（7.82±0.05）%天冬氨酸，推測其具有一定的抗疲勞功效。

2.2 低值海洋魚低聚肽分子質(zhì)量分布

小肽能直接參與組織蛋白質(zhì)合成代謝，具有吸收快、耗能低且不易飽和的特點。高強度運動下，補充小肽可以迅速為機體提供能量，補充消耗的糖原[27-28]。

圖1 低值海洋魚低聚肽凝膠過濾色譜圖Fig.1 Gel fi ltration chromatogram of the oliogopeptide

表2 低值海洋魚低聚肽分子質(zhì)量分布Table2 Molecular mass distribution of the oliogopeptide

由圖1可知，低值海洋魚低聚肽的分子質(zhì)量集中在1 000 Da以下。從表2可以看出，分子質(zhì)量在180～1 000 Da的組分含量較多，峰面積占總面積的91.50%，其中二肽和三肽（180～500 Da）占87.23%，還有7.96%左右的組分為游離氨基酸和水解過度的氨基酸殘基。

2.3 低值海洋魚低聚肽體外抗氧化活性

以GSH為陽性對照，對低值海洋魚低聚肽超氧陰離子、DPPH和羥自由基的清除能力以及還原力多個體系進行測定，綜合評價其抗氧化活性。

表3 低值海洋魚低聚肽體外抗氧化活性Table3 In vitro antioxidant activity of the oliogopeptide

從表3可知，低值海洋魚低聚肽抑制DPPH自由基IC50為（4.76±0.57）mg/mL，高于陽性對照，表明低值海洋魚低聚肽有DPPH自由基清除活性，但清除活性較弱。低值海洋魚低聚肽抑制羥自由基IC50為（5.09±0.21）mg/mL，比陽性對照IC50低11.6%，說明低值海洋魚低聚肽羥自由基清除活性較強。低值海洋魚低聚肽的還原力、超氧陰離子自由基清除能力IC50分別為（1.31±0.12）mg/mL和（5.91±0.23）mg/mL，分別是陽性對照IC50的1.75 倍和2.88 倍，表明低值海洋魚低聚肽有一定的還原力及抑制超氧陰離子自由基能力。

2.4 低值海洋魚低聚肽對AAPH誘導(dǎo)質(zhì)粒pBR322氧化損傷的影響

AAPH均裂分解產(chǎn)生的自由基能引起DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子氧化損傷，加速細胞衰老與凋亡，導(dǎo)致多種疾病[29-31]。

圖2 AAPH對DNA氧化損傷作用Fig.2 DNA oxidative damage induced by AAPH

如圖2所示，對于未處理的pBR322質(zhì)粒，電泳圖譜中超螺旋DNA是優(yōu)勢條帶，經(jīng)AAPH處理后，DNA氧化斷裂，超螺旋主要轉(zhuǎn)化為開環(huán)態(tài)。AAPH濃度為40 mmol/L時，超螺旋DNA條帶消失，濃度大于40 mmol/L時，所有形式的DNA都被降解，綜合考慮，40 mmol/L為最佳損傷濃度。

如圖3所示，以VC為對照，在AAPH誘導(dǎo)體系中，隨著低值海洋魚低聚肽質(zhì)量濃度的增加，超螺旋DNA逐漸增多，質(zhì)量濃度為20 mg/mL時開環(huán)DNA基本消失，完全起到保護DNA的作用。充分說明了低值海洋魚低聚肽對DNA氧化損傷具有一定的修復(fù)作用，且質(zhì)量濃度越高保護效果越好。

圖3 低值魚低聚肽對DNA氧化損傷的保護活性Fig.3 Protective effect of the oliogopeptide on DNA oxidative damage

2.5 小鼠體質(zhì)量的變化

小鼠體質(zhì)量的變化反映了低值海洋魚低聚肽對小鼠健康狀況的影響，小鼠體質(zhì)量增加或減少過快，都不利于其健康。

表1 低值海洋魚低聚肽對小鼠體質(zhì)量的影響Table1 Effect of the oliogopeptide on body mass of mice g

表4反映了灌胃期間小鼠體質(zhì)量的變化情況。初始時每組小鼠體質(zhì)量相差不明顯，隨著灌胃時間的延長，體質(zhì)量不斷增加，但各組小鼠體質(zhì)量每周增加幅度無顯著性差異（P＞0.05），其中實驗組與空白組、陽性對照組相比均沒有達到顯著性差異（P＞0.05）。觀察小鼠行為特征，各組小鼠均精神狀態(tài)良好，未發(fā)現(xiàn)異?；蛩劳霈F(xiàn)象，表明低聚肽并不會影響小鼠正常生長。

2.6 小鼠力竭游泳時間

力竭游泳是評價抗疲勞能力的一種實驗?zāi)Ｐ?，它能夠很好地評價小鼠的疲勞耐受能力，再現(xiàn)性較高[32]。

圖1 低值海洋魚低聚肽對小鼠負重力竭游泳時間的影響Fig.1 Effect of the oliogopeptide on exhaustive swimming time of mice

由圖4可知，與空白組相比，中、高劑量組均顯著延長了小鼠負重力竭游泳時間（P＜0.05），高劑量組力竭游泳時間為（112.16±4.55）min，為空白組的1.46 倍。說明低值海洋魚低聚肽能延長小鼠負重力竭游泳時間，提高小鼠運動耐力，具有良好的緩解體力疲勞作用。

2.7 小鼠運動后各組乳酸、尿素氮和肝糖原水平變化

表5 小鼠乳酸、尿素氮和肝糖原水平的變化Table5 Changes in lactic acid, blood urea nitrogen and glycogen contents in mice from all groups

長時間運動使有氧肌肉活動轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧代謝，糖酵解加快，乳酸大量堆積，肌肉中H＋濃度升高，pH值下降，給機體帶來延遲性酸痛，造成疲勞。因此，機體內(nèi)乳酸含量既是引發(fā)疲勞的一個主要因素，也是評價機體有氧代謝能力和疲勞程度的敏感指標[33-34]。如表5所示，游泳30 min后，小鼠血液中高、中、低劑量組乳酸濃度分別比空白組降低了20.80%、12.93%和9.40%，且各劑量組與空白組之間達到顯著性差異（P＜0.05），說明低值海洋魚低聚肽能夠清除或延緩小鼠體內(nèi)乳酸堆積。

血尿素是蛋白質(zhì)代謝分解終產(chǎn)物，安靜狀態(tài)下其生成與排泄處于動態(tài)平衡[35-36]。劇烈運動后，機體血糖降低、糖原消耗，進一步分解蛋白質(zhì)滿足對能量的需求，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化功能比例增加。血清尿素氮是能量代謝產(chǎn)物，其濃度直接反映血尿素水平，是衡量機體疲勞程度的重要指標。如表5所示，高、中、低劑量組低值海洋魚低聚肽血清尿素氮的濃度分別比空白組降低了22.61%、19.65%和9.39%（P＜0.05）。說明低值海洋魚低聚肽在一定程度上減緩小鼠運動后尿素氮濃度的升高，具有抗疲勞功效。

有氧或無氧條件下，糖原均會迅速分解產(chǎn)生ATP，維持機體血糖平衡。因此，糖原含量高低是機體運動耐受力的重要標志，也是測定疲勞程度的一項重要指標[37-39]。

由表5可知，低、中、高劑量組肝糖原含量分別是空白組的1.67、1.77 倍和1.91 倍（P＜0.05）；陽性對照組與空白組之間無顯著性差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，低值海洋魚低聚肽抗疲勞活性與能量代謝的激活及運動代謝的改善有關(guān)。

2.8 低值魚低聚肽對SOD、CAT和GSH-Px活力的影響

SOD是細胞防御氧自由基的第一道防線，能夠特異性地清除超氧陰離子自由基，催化生成H2O2，保護細胞免受自由基攻擊[40]。因此，提高其在機體內(nèi)的活力能夠加快ROS自由基的清除，緩解疲勞。

圖5 低值海洋魚低聚肽對CAT、SOD和GSH-Px活力的影響Fig.5 Effect of the oliogopeptide on antioxidant enzyme activities in mice

如圖5所示，與空白組相比，低值海洋魚低聚肽低、中、高劑量組均使小鼠肝臟中SOD活力提高，分別提高了2.07%、14.77%和19.22%。其中，中、高劑量組與空白組相比差異顯著（P＜0.05）；與陽性對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。

CAT可催化體內(nèi)H2O2分解生成H2O和O2，GSH-Px能夠阻斷體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整[41]。因此，CAT和GSH-Px含量是評價機體抗氧化能力大小的標準。從圖5可以看出，低值海洋魚低聚肽3 個劑量組CAT活力分別比空白組提高了4.80%、22.65%和45.53%，GSH-Px活力比空白組提高了4.60%、14.44%和24.84%。其中，中、高劑量組小鼠肝臟中CAT和GSH-Px活力顯著高于空白組（P＜0.05）；低劑量組與空白組相比無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，低值海洋魚低聚肽能提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶系的活力，清除因運動而產(chǎn)生的自由基，緩解疲勞。

3 討 論

羥自由基、超氧陰離子自由基和H2O2是生物系統(tǒng)中主要的ROS自由基，它們可以導(dǎo)致組織脂質(zhì)過氧化作用加強，生物膜正常結(jié)構(gòu)與功能遭到破壞，ATP合成和供給減少。有抗氧化活性的天然產(chǎn)物能切斷或清除過氧化鏈式反應(yīng)，減少自由基對機體的損傷，延緩疲勞。鰹魚（Katsuwonus pelamis）暗色肉[42]、紅牙?（Otolithes ruber）魚肉[43]和秋刀魚（Cololabis saira Brevoort）魚肉[44]等多種蛋白質(zhì)酶解物及其分離多肽已顯示出體外抗氧化活性。體外抗氧化活性實驗結(jié)果表明，低值海洋魚低聚肽具有一定的清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基能力及較強的羥自由基清除能力，以及一定的還原力。說明低值海洋魚低聚肽具有減少體內(nèi)氧化應(yīng)激的潛力，能夠抗疲勞。

機體不能持續(xù)特定水平或器官不能維持預(yù)定運動強度的生理狀態(tài)即為疲勞。耐力測試是評價疲勞程度最直接、最客觀的指標。ATP、糖原作為能量物質(zhì)，乳酸、尿素氮作為機體代謝產(chǎn)物，SOD、CAT等抗氧化酶體系，其水平可作為檢測是否具有抗疲勞活性的指標。低值海洋魚低聚肽動物實驗結(jié)果與王雪芹[45]研究鮐魚抗疲勞作用相似，均延長了小鼠力竭游泳時間，降低了運動后乳酸及尿素氮的水平，消除代謝產(chǎn)物的累積，增加了肝糖原儲備，提高了內(nèi)源性抗氧化酶體系的活力。由于抗疲勞機制復(fù)雜多變，需要深入研究其構(gòu)效關(guān)系，為以后開發(fā)保健食品和新藥提供理論支持。