岳思遠(yuǎn)，蘇 亮，任鵬程，劉陽泰，王 翔，劉 箐，董慶利,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100022）

食源性致病菌是一類以食品為傳播媒介，可引起食物中毒的致病性微生物，是目前食源性疾病的主要誘因。由食源性致病菌引起的食源性疾病是國際性公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織2017年的報(bào)告表明，全球食源性疾病患者約6億，由食源性疾病引起的死亡人數(shù)約42萬，其中5歲以下兒童死亡人數(shù)約12.5萬[1]。近年來我國建立了食源性疾病監(jiān)測(cè)信息數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)分析監(jiān)測(cè)網(wǎng)地區(qū)14 年間8 000余起食物中毒案例，發(fā)現(xiàn)微生物性病原仍然是我國食源性疾病的主要病因（占30%～40%）[2]。同時(shí)，我國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)（原國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)）辦公廳發(fā)布2017年第4季度的食物中毒公告顯示，食物中毒事件報(bào)告數(shù)量和中毒人數(shù)最多的是微生物性食物中毒事件，分別占總報(bào)告數(shù)量和總中毒人數(shù)的34.6%和55.5%[3]。因此，需嚴(yán)格控制食品中食源性致病菌的數(shù)量及生長，以保證食品食用的安全性。

近年來，隨著人們對(duì)食品安全的重視，預(yù)測(cè)微生物學(xué)也得到了良好的發(fā)展。通常情況下，微生物生長一般會(huì)經(jīng)歷4 個(gè)階段：延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期。目前微生物延滯期仍未基于微生物生長機(jī)理明確定義，生物學(xué)上被普遍接受的定義是：微生物群體經(jīng)歷環(huán)境突變，自我調(diào)整后開始繁殖的時(shí)間[4]。幾何意義上微生物延滯期是指微生物對(duì)數(shù)生長期達(dá)到最大比生長速率時(shí)，生長曲線切線的反向延長線和初始菌量水平延長線的交點(diǎn)在時(shí)間軸上的投影點(diǎn)與零時(shí)刻的時(shí)間間隔[5]。在傳統(tǒng)預(yù)測(cè)微生物生長的模型中，延滯期常通過生長曲線確定。而應(yīng)用數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)微生物生長時(shí)，延滯期較最大比生長速率受更多因素影響，因此延滯期較最大比生長速率更難以準(zhǔn)確獲取。

預(yù)測(cè)微生物學(xué)作為食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要工具，已被廣泛應(yīng)用于食品安全風(fēng)險(xiǎn)控制中，然而因延滯期尚未明確定義，且影響因素較多，相較于最大比生長速率預(yù)測(cè)模型更難以準(zhǔn)確估計(jì)微生物生長延滯期，因此延滯期研究仍具有較大的發(fā)展空間，需進(jìn)一步探討。以下分述微生物生長延滯期的測(cè)定方法和建模方法的研究進(jìn)展。

1 延滯期的測(cè)定方法

現(xiàn)有技術(shù)并不能直接測(cè)定微生物生長延滯期，需通過已建立的微生物生長模型擬合生長曲線，間接獲取延滯期。在預(yù)測(cè)微生物學(xué)中，微生物生長模型的建立需確定微生物生長曲線，微生物生長曲線的獲取和記錄可采用多種方法?；谖⑸锶后w水平和單細(xì)胞水平下不同的延滯期概念，延滯期的測(cè)定分別從群體水平和單細(xì)胞水平進(jìn)行論述。

1.1 群體生長延滯期的測(cè)定

目前測(cè)定微生物生長曲線的方法主要分為傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法。表1中總結(jié)了應(yīng)用傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法測(cè)定微生物生長曲線進(jìn)而通過模型擬合獲取生長延滯期的相關(guān)研究。傳統(tǒng)測(cè)定微生物生長曲線的方法是活菌計(jì)數(shù)法，因其不受菌懸液顏色及濁度的影響而成為測(cè)定食品中食源性致病菌的主流手段。但是該方法操作繁瑣、耗時(shí)耗力，且應(yīng)用該方法獲取的生長參數(shù)準(zhǔn)確性與數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量及觀測(cè)點(diǎn)的位置均相關(guān)[23]，因此活菌計(jì)數(shù)法還需進(jìn)一步改進(jìn)。相較于活菌計(jì)數(shù)法，比濁法因其操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于微生物生長曲線的測(cè)定和建模研究中[12,24]。然而，比濁法的檢測(cè)限僅能達(dá)到106～107CFU/mL，且只可用于液體培養(yǎng)基的測(cè)定，同時(shí)因測(cè)定的菌懸液濃度并不是活菌濃度而導(dǎo)致獲得的生長參數(shù)有些許誤差。建議今后的研究可基于技術(shù)層面對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化，使其能更好地描述低濃度食源性致病菌的生長，為進(jìn)一步研究微生物生長提供依據(jù)。

表1 應(yīng)用各種方法測(cè)定食源性致病菌生長曲線的相關(guān)研究Table1 A summary of methods for determining the growth curve of foodborne pathogenic bacteria

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)和PCR等分子生物學(xué)技術(shù)也被應(yīng)用于微生物生長曲線的測(cè)定，相較于傳統(tǒng)方法，這些分子生物學(xué)技術(shù)具有省時(shí)省力、高效等優(yōu)點(diǎn)，且可同時(shí)測(cè)定兩種細(xì)菌的生長，極大地改善了傳統(tǒng)方法的不足[25]。Liao Chao等[18]應(yīng)用DGGE結(jié)合PCR技術(shù)測(cè)定了單增李斯特菌和副溶血性弧菌的生長情況，進(jìn)而通過Baranyi模型擬合其生長曲線獲取延滯期。傳統(tǒng)PCR技術(shù)需結(jié)合DGGE技術(shù)才可定量測(cè)定微生物的生長情況，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技術(shù)[26]的出現(xiàn)彌補(bǔ)了其缺陷，實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的突破。Guan Zhengping等[27]將金黃色葡萄球菌的菌液接種于豬肉中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間提取生長后細(xì)菌的總基因組DNA，并對(duì)其進(jìn)行qPCR分析，進(jìn)而根據(jù)已建立的微生物濃度與qPCR的循環(huán)閾（cycle threshold，Ct）值間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量描述豬肉中金黃色葡萄球菌的生長情況，最后應(yīng)用模型擬合其生長曲線，間接獲取生長延滯期。Ye Keping[20]和孫文爍[21]等也同樣應(yīng)用qPCR技術(shù)分別定量描述了豬肉中單增李斯特菌和即食南美白對(duì)蝦中副溶血性弧菌的生長情況，并對(duì)其進(jìn)行模型擬合，獲取了延滯期。但因qPCR技術(shù)無法區(qū)分活菌和死菌，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的誤差?；诖?，Zhang Zhaohuan等[22]將疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）與多重qPCR技術(shù)相結(jié)合，極好地定量描述了生鮮南美白對(duì)蝦樣品中副溶血性弧菌和單增李斯特菌的生長行為。雖然PMA的應(yīng)用可區(qū)分活死菌，但其會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生一定的損傷。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為預(yù)測(cè)微生物學(xué)注入了新的活力，加速了預(yù)測(cè)微生物學(xué)的發(fā)展。然而，任何方法均需辯證地看待，即每一種方法均各有優(yōu)點(diǎn)和局限性，因此分子生物學(xué)技術(shù)并不能完全取代傳統(tǒng)方法，仍需根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的實(shí)驗(yàn)方法。

1.2 單細(xì)胞生長延滯期的測(cè)定

單細(xì)胞生長延滯期的研究對(duì)象為單細(xì)胞，其分布研究需獲取大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此，傳統(tǒng)的活菌計(jì)數(shù)法并不適用于開展單細(xì)胞水平研究，需采用其他方法測(cè)定單細(xì)胞延滯期。

單細(xì)胞生長延滯期可通過直接觀測(cè)單細(xì)胞分裂過程進(jìn)行測(cè)定。最早可追溯到Kelly等[28]的相關(guān)研究，將少量微生物接種于瓊脂薄膜上，并置于顯微鏡下觀測(cè)微生物單細(xì)胞個(gè)體的分裂過程，結(jié)果表明，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，分裂時(shí)間間隔隨之下降。基于固體培養(yǎng)觀測(cè)法，董慶利等[29]設(shè)計(jì)流動(dòng)槽裝置，顯微觀測(cè)銅綠假單胞菌單細(xì)胞的生長分裂情況，流動(dòng)槽通過液體流動(dòng)帶走新分裂的子細(xì)胞，進(jìn)而持續(xù)觀測(cè)一個(gè)目標(biāo)細(xì)胞多次分裂的情況。固體培養(yǎng)顯微觀測(cè)法和液體培養(yǎng)顯微觀測(cè)法的實(shí)質(zhì)均是通過單細(xì)胞分裂時(shí)間計(jì)算單細(xì)胞延滯期。雖然顯微觀測(cè)法可直接觀測(cè)單細(xì)胞生長分裂的過程，但是該法對(duì)儀器設(shè)備要求較高且耗時(shí)耗力。同時(shí)，采用顯微觀測(cè)法開展單細(xì)胞延滯期分布的研究難以獲取大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

比濁法通過間接推斷計(jì)算單細(xì)胞生長延滯期。與群體水平的觀測(cè)不同，比濁法應(yīng)用Bioscreen FP-1100C型全自動(dòng)微生物生長曲線分析儀實(shí)時(shí)連續(xù)記錄單細(xì)胞生長情況，進(jìn)而通過檢測(cè)時(shí)間（the time to detection，Tdet）計(jì)算單細(xì)胞延滯期。比濁法中的檢測(cè)時(shí)間是指初始OD值增加至對(duì)應(yīng)于菌懸液菌落總數(shù)為107CFU/mL時(shí)OD值的時(shí)間。McKellar[30]通過不同稀釋度的菌液與檢測(cè)時(shí)間線性回歸獲得回歸曲線的斜率（slope），進(jìn)而計(jì)算最大比生長速率（μmax），計(jì)算公式如式（1）所示。

進(jìn)而再采用已得的μmax和模型估計(jì)Tdet，預(yù)測(cè)得到的Tdet和實(shí)測(cè)Tdet的差值即為單細(xì)胞延滯期。此后，Baranyi等[31]在前人研究的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了單細(xì)胞延滯期的計(jì)算方式。假設(shè)Bioscreen微型孔板100 孔中每個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)為1，且單細(xì)胞生長數(shù)量服從泊松分布[32]，同時(shí)，細(xì)菌在對(duì)數(shù)期以恒定生長速率（μmax）生長，則單細(xì)胞延滯期即可通過公式（2）計(jì)算，生長曲線如圖1所示[5]。

式中：x0為初始細(xì)胞數(shù)/（CFU/mL）；xdet為達(dá)到檢測(cè)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)/（CFU/mL）；Tdet為初始OD值達(dá)到菌懸液菌落總數(shù)為107CFU/mL所對(duì)應(yīng)OD值的時(shí)間/h；μ為對(duì)數(shù)期細(xì)菌生長的恒定生長速率/h－1；λ為單細(xì)胞生長延滯期/h。

圖1 微生物生長曲線[5]Fig.1 Microbial growth curve[5]

經(jīng)Bioscreen FP-1100C型全自動(dòng)微生物生長曲線分析儀測(cè)定單細(xì)胞延滯期的比濁法可連續(xù)監(jiān)測(cè)大量單細(xì)胞的生長情況且省時(shí)省力，已廣泛用于單細(xì)胞延滯期分布的研究。

綜上所述，雖然微生物群體延滯期和單細(xì)胞延滯期均可采用上述方法間接獲得，但是微生物群體延滯期會(huì)因擬合模型不同而不同，同時(shí)微生物單細(xì)胞生長觀測(cè)方法依然存在精度低、控制難、耗時(shí)長等問題。因此，需在明確延滯期定義的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)已有的微生物觀測(cè)手段以提高生長模型預(yù)測(cè)延滯期的準(zhǔn)確性。

2 延滯期的建模方法

在預(yù)測(cè)微生物學(xué)中，微生物生長模型一般根據(jù)變量類型分為三大類：一級(jí)模型是描述恒定環(huán)境條件下微生物數(shù)量與時(shí)間的關(guān)系；二級(jí)模型是描述微生物生長參數(shù)（延滯期（λ）和最大比生長速率（μmax））與環(huán)境變量（如溫度、pH值和水分活度等）間的關(guān)系；三級(jí)模型是基于一級(jí)模型和二級(jí)模型，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件獲取微生物生長參數(shù)[33]。

基于微生物生長延滯期的測(cè)定方法，微生物群體延滯期需通過生長模型擬合生長曲線間接獲取。表2歸納了可描述微生物生長曲線的一級(jí)模型。

表2 預(yù)測(cè)微生物學(xué)中常見的一級(jí)模型Table2 Primary models in predictive microbiology

由表2可知，與其他模型相比，三段式線性模型因分段描述微生物生長較難實(shí)現(xiàn)擬合。而Gompertz模型和Logistic模型最初并不是基于微生物學(xué)概念建立的模型。同時(shí)，Gompertz模型描述的S型曲線中，拐點(diǎn)處的確定曲率會(huì)導(dǎo)致高估延滯期[39-40]。與其他模型相比，Huang模型與Baranyi模型有一定的生理學(xué)意義，均為機(jī)械模型。

在預(yù)測(cè)微生物學(xué)中，被人普遍接受的一級(jí)模型為Baranyi模型[37]，該模型引入了細(xì)胞生理狀態(tài)（Q）這一生理學(xué)概念，公式如式（3）、（4）所示。

將Baranyi模型式（3）中的Q（t）/（1＋Q（t））為調(diào)整函數(shù)α（t）。α（t）描述微生物延滯期向?qū)?shù)生長期的轉(zhuǎn)換。假設(shè)微生物生長由某一物質(zhì)P（t）控制，且該物質(zhì)的累積遵循Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)，則α（t）的計(jì)算如式（5）所示。

式中：Kp為米氏常數(shù)，當(dāng)微生物生長過程中環(huán)境條件改變時(shí)，調(diào)整函數(shù)α（t）取決于P（t）/Kp速率。P（t）/Kp速率用于表征細(xì)胞的生理狀態(tài)Q（t）。Baranyi模型中延滯期可用細(xì)胞生理狀態(tài)表示，公式如式（6）所示。

式中：Q（0）為細(xì)胞的初始生理狀態(tài)；h0為α（t）與Q（t）在數(shù)學(xué)意義上的轉(zhuǎn)換參數(shù)。

除延滯期一級(jí)建模外，還存在延滯期的二級(jí)建模。目前最常用的延滯期二級(jí)模型是Ratkowsky等[41]于1982年提出的平方根模型，用于描述微生物延滯期隨溫度的變化情況，具體表達(dá)式如式（7）所示。

式中：λ為微生物生長延滯期/h；b為平方根模型的系數(shù)；T為微生物培養(yǎng)溫度/℃；Tmin為微生物理論最低生長溫度/℃。

延滯期的二級(jí)模型僅適用于描述微生物延滯期隨溫度的變化，而微生物所處生長環(huán)境較為復(fù)雜，因此，延滯期二級(jí)模型存在一定的局限性，建議在建模過程中增加其他影響因素。

延滯期的獲取一般需將實(shí)驗(yàn)獲取的微生物生長數(shù)據(jù)輸入到三級(jí)模型即計(jì)算機(jī)軟件中，進(jìn)而再選擇軟件中的一級(jí)模型進(jìn)行擬合，獲得相應(yīng)的生長參數(shù)，其中包括延滯期。表3總結(jié)了目前國內(nèi)外可獲取延滯期的相關(guān)軟件，其中以英國食品研究所開發(fā)的ComBase和美國農(nóng)業(yè)部開發(fā)的病原菌模型程序（pathogen modeling program，PMP）最為著名[45]。由表3可知，每個(gè)軟件中所包含的一級(jí)模型并不是很全面，因此，建議在日后的軟件開發(fā)方面，盡可能將所有一級(jí)模型編入程序中，供使用者自由選擇合適的生長模型進(jìn)行延滯期的獲取。

表3 預(yù)測(cè)微生物學(xué)中的相關(guān)軟件Table3 Overview of predictive microbiology software tools

綜上所述，雖然已有諸多一級(jí)模型可描述微生物生長，但是現(xiàn)有一級(jí)模型均是基于群體建立的，未考慮單細(xì)胞生長變異性。同時(shí)，因已有一級(jí)模型中的數(shù)學(xué)概念并不能通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，還需進(jìn)一步改進(jìn)已有模型或建立新模型以提高生長模型預(yù)測(cè)延滯期的準(zhǔn)確性。除此之外，基于現(xiàn)有一級(jí)模型，還需在已有的計(jì)算機(jī)軟件中添加部分一級(jí)模型，或開發(fā)新的覆蓋所有一級(jí)模型的計(jì)算機(jī)軟件，從而在應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行模型擬合時(shí)實(shí)現(xiàn)一級(jí)模型的最優(yōu)選擇。

3 結(jié) 語

雖然目前的已有研究可觀測(cè)食源性致病菌的生長，也可應(yīng)用模型擬合生長曲線獲得生長延滯期，但仍需改進(jìn)測(cè)定食源性致病菌生長的方法和擬合食源性致病菌生長的模型，進(jìn)一步完善食源性致病菌生長延滯期建模工作。建議食源性致病菌生長延滯期建模及預(yù)測(cè)的研究方向如下：首先，應(yīng)從機(jī)理出發(fā)，進(jìn)一步明確食源性致病菌生長延滯期定義，為延滯期建模提供理論依據(jù)；其次，基于目前已有的延滯期觀測(cè)手段，改進(jìn)傳統(tǒng)計(jì)數(shù)法耗時(shí)費(fèi)力等問題，或優(yōu)化分子生物學(xué)技術(shù)的精度及特異性，為延滯期的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)提供幫助；最后，延滯期建模中的模型仍存在一定問題，建議改進(jìn)現(xiàn)有一級(jí)模型的部分參數(shù)或基于延滯期機(jī)理建立新的延滯期模型，同時(shí)優(yōu)化已有三級(jí)模型或開發(fā)新的三級(jí)模型，使其覆蓋所有延滯期模型，為延滯期建模的發(fā)展提供強(qiáng)有力的支持。