牛 放，高俊明，段雪薇，鄭 放，田 薇

(浙江農(nóng)林大學林業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江杭州311300)

野菊花(Chrysanthemum indicum flowers)為多年生草本植物野菊的干燥頭狀花序［1］，具有清熱解毒、清肝明目的功效，用于緩解破血疏肝、解療散毒、頭痛眩暈等癥狀［2－4］。近些年來，植物多糖由于具有廣泛的生物學活性和相對低的毒性，已經(jīng)引起了許多專家學者的關(guān)注［5］。然而，多糖化學結(jié)構(gòu)復(fù)雜且有較大的相對分子質(zhì)量，多糖質(zhì)量控制一直難以把控。野菊花中的活性成分較多［6］，其活性與其相對分子質(zhì)量、化學組成、苷鍵構(gòu)型、連接方式和空間構(gòu)型有關(guān)［7］，為了解野菊花多糖的特性，可以采用水解反應(yīng)，分析單糖組成及含量的變化，為進一步為野菊花多糖的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

已有報道中涉及多糖水解的研究局限于部分酸水解，水解產(chǎn)物的基本結(jié)構(gòu)常具有代表性，有利于進行各種分析。徐春梅等［8］在魔芋葡甘露聚糖的水解條件的研究以及杜秉健等［9］人在南瓜多糖水解過程的研究中，皆采用平均聚合度來評價水解程度，但低聚糖的聚合度不能說明多糖完全水解成單糖，而只能說明多糖被降解;繆月秋等［10］研究了葫蘆巴中性多糖酸水解和胡堯超等［11］關(guān)于油茶籽油優(yōu)化糖化的研究是以寡糖或還原糖的產(chǎn)量判斷其水解程度，也沒有明確提出多糖被完全降解。為了確保良好的單糖回收并對單糖結(jié)構(gòu)進行測定，多糖水解的最佳優(yōu)化條件應(yīng)該完全水解成單糖，而不是部分酸水解［12］產(chǎn)生寡糖。鮮有研究通過單糖產(chǎn)率來評估水解程度，也沒有關(guān)于使用響應(yīng)面試驗優(yōu)化野菊花多糖水解條件的報道。前人研究表明，控制水解時間、水解溫度和酸的濃度［13］等條件可以達到不同程度的水解目的。隨著實驗步驟的簡化，更多實驗選用三氟乙酸(TFA)來水解植物多糖［14］，一方面三氟乙酸可以有效地水解糖苷鍵，且不會過多地損害多糖的結(jié)構(gòu)，另一方面三氟乙酸經(jīng)減壓蒸發(fā)可除去，避免了傳統(tǒng)的中和步驟。

本文以野菊花為實驗對象，通過單因素實驗，確定水解時間、溫度和三氟乙酸用量對野菊花多糖水解的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以氣相色譜圖中單糖總峰面積為指標，利用響應(yīng)面試驗，優(yōu)化野菊花多糖的水解工藝，為確定野菊花多糖的結(jié)構(gòu)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野菊花 采自浙江省遂昌縣野菊種植基地，經(jīng)浙江農(nóng)林大學田薇教授鑒定為菊科菊屬植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的花序;三氯乙酸(TCA)、三氟乙酸(TFA)、正丁醇、過氧化氫、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、氨水、磷酸二氫鉀、三氯甲烷(氯仿) 均為國產(chǎn)分析純化學試劑;DEAE－52纖維素、Sephadex G－100 北京索萊寶生物科技有限公司;1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮(PMP) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;葡萄糖(Glu)、木糖(Xyl)、半乳糖 (Gal)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、果糖(Fru)、甘露糖(Man)標準品 純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司;蒸餾水 實驗室自制。

DZG－6050型真空干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司;HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;Spectrumlab 22PC可見分光光度計 上海滬粵明科學儀器有限公司;TU1800紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;VirTis Benchtop SLC型凍干機 美國VirTis公司;Agilent GC－7890B氣相色譜儀、氫火焰離子化檢測器(FID) 美國Agilent公司;粉碎機 北京田園機械技術(shù)有限公司;SHB－D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 杭州明遠儀器有限公司;R－201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司;AR1140分析天平梅特勒－托利多儀器制造有限公司;透析袋(3500) 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野菊花多糖的提取與純化 根據(jù)房海靈等［15］的方法改進后提取野菊花多糖，前期房海靈等研究野菊花多糖含量只以葡萄糖為研究對象，忽略了其他單糖組成，經(jīng)完善后具體方法如下:將收集到的野菊花用粉碎機打粉后，放入烘箱70℃烘干12 h，取干燥后的野菊花粉末200 g于燒杯中，加入25倍體積的蒸餾水，于90℃水浴鍋提取約3 h，過濾，重復(fù)3次，合并濾液濃縮至約200 mL;加入5倍體積的95%乙醇沉淀，在4℃下溫育12 h，離心(4000 r/min，5 min)后，再次加入95%乙醇洗滌兩次，最后收集沉淀物。

為了提高多糖的純度，用Sevag法［16］除去游離蛋白，將除蛋白后的多糖溶液加入1/6體積的30%過氧化氫攪拌均勻，滴加氨水使pH=7.8，置于50℃水浴孵育3 h，冷卻過濾并濃縮，收集濾液;再加入4～5倍95%的乙醇過夜，過濾收集沉淀，將沉淀物完全溶解于蒸餾水中配成10 mg/mL的粗多糖溶液，裝入透析袋(3500)中在蒸餾水中透析72 h;收集透析袋內(nèi)的多糖溶液(截留Mw＞3500)再次用95%乙醇沉淀滯留物部分，經(jīng)濃縮后冷凍干燥［17］，最終得到多糖樣品。

1.2.2 野菊花多糖的水解 鑒定多糖中的單糖組成，需先將多糖水解再進行測定。野菊花多糖的水解采用三氟乙酸法［18］:準確稱取純化后的野菊花多糖樣品100 mg于10 mL的安培瓶中，加入一定量的2 mol/mL的三氟乙酸，用酒精燈加熱封口，烘箱調(diào)至一定溫度后，水解一定時間，冷卻后用濾膜過濾除去不溶物，將所得濾液經(jīng)減壓旋蒸除去三氟乙酸，加入少量甲醇，再次蒸干，如此重復(fù)三次，以徹底除去殘留的三氟乙酸，最后定容至5 mL。

1.2.2.1 單因素實驗 本實驗以水解出來的單糖峰面積為指標，考察水解溫度、水解時間和三氟乙酸用量對單糖峰面積的影響。固定三氟乙酸用量為3 mL，水解時間為8 h，分別設(shè)置水解溫度為80、90、100、110、120℃;固定三氟乙酸用量為3 mL，水解溫度為100 ℃，分別設(shè)置水解時間為4、6、8、10、12 h;固定水解溫度為100℃，水解時間為8 h，分別設(shè)置三氟乙酸用量為1、2、3、4、5 mL。每個實驗平行三次，結(jié)果取平均值。

1.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，依據(jù) Design－Expert 8.0.6 Trial軟件，運用 Box－Behnken中心組合實驗設(shè)計原理［19－20］，以水解時間(A)、水解溫度(B)、三氟乙酸用量(C)三個因子為自變量，以野菊花多糖水解出來的單糖總峰面積(Y)為響應(yīng)值，對野菊花多糖的水解條件進行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗的因素及水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.3 野菊花多糖的衍生化 水解條件是影響單糖測定的主要因素，通過不同水解條件進行衍生化來測定純化后野菊花多糖的單糖組成［21］。衍生化方法如下:水解后的野菊花多糖樣品加蒸餾水定容至10 mL，單糖標品 (Glu、Xyl、Gal、Ara、Rha、Fru 和Man)各10 mg加入蒸餾水定容至10 mL，隨即取0.5 mL于10 mL容量瓶中，向其加入0.5 mL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和0.5 mL 3 mol/L的NaOH溶液，充分振蕩，于70℃水浴反應(yīng)60 min，取出冷卻至室溫，加入0.5 mL 0.3 mol/L的鹽酸溶液;再加1 mL氯仿萃取，靜置30 min，移去下層液體重復(fù)三次;蒸餾水定容至10 mL過濾，所得濾液供氣相分析。

1.2.4 氣相色譜條件 采用HP－5(30 m×320μm×0.25μm)彈性石英毛細管柱;檢測器溫度260℃，分流比25∶1，進樣量 1 μL，氫氣流速 30 mL，空氣流速400 mL;程序升溫:起始溫度125 ℃，以1 ℃·min－1上升到128℃，保持5 min，之后先以0.1℃·min－1上升至129℃，再以1℃·min－1上升到140℃，最后以5 ℃·min－1上升到280 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)通過ANOVA程序進行方差分析，使用統(tǒng)計軟件(Design－Expert 8.0.6)設(shè)計響應(yīng)面試驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 時間對野菊花多糖水解作用的影響 在多糖水解過程中選擇合適的反應(yīng)時間尤為重要。結(jié)果如圖1所示，隨著水解時間的增加，野菊花多糖的水解速率加快，在8 h單糖峰面積均達到最大，隨后單糖峰面積保持不變，說明水解已經(jīng)達到完全;可見時間對野菊花多糖水解有一定影響，最佳水解時間為8 h。

圖1 水解時間對野菊花多糖水解作用的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis of Chrysanthemum polysaccharides

2.1.2 溫度對野菊花多糖水解作用的影響 多糖的單糖組成是表征其結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，單糖的組成及含量不同影響多糖的藥理活性，升溫可以使多糖的糖苷鍵斷裂水解成單糖。由圖2可知，溫度越高，多糖水解的速率加快，各個單糖的峰面積迅速增加，從100℃開始趨于穩(wěn)定，到120℃單糖峰面積不變，說明多糖水解趨于完全;溫度過高導(dǎo)致能量的浪費。因此最適宜的水解溫度為100℃。

圖2 溫度對野菊花多糖水解作用的影響Fig.2 Effect of temperature on hydrolysis of Chrysanthemum polysaccharides

2.1.3 三氟乙酸用量對野菊花多糖水解作用的影響 酸的濃度是影響多糖水解速率的重要因素。如圖3所示，各個單糖的峰面積隨著三氟乙酸用量的增加而增大，三氟乙酸用量為3 mL時達到最大，隨后降低，但變化程度不大;隨著三氟乙酸濃度的增加，大部分單糖含量增加，但野菊花多糖隨著三氟乙酸濃度的增加會使單糖的含量降低，這個可能與多糖的類型和性質(zhì)有關(guān);故選擇3 mL的三氟乙酸用量為最佳。

圖3 三氟乙酸用量對野菊花多糖水解作用的影響Fig.3 Effect of the amount of trifluoroacetic acid on the hydrolysis of Chrysanthemum polysaccharides

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)值的選取 通過單因素實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野菊花多糖水解后產(chǎn)生的單糖包括鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、果糖，說明野菊花多糖完全水解可生成7種單糖，因此選取這7種單糖的峰面積和作為響應(yīng)面設(shè)計中的響應(yīng)值，以七種單糖的總峰面積達到最大為目標，通過響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化野菊花多糖水解的最佳條件。

2.2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面分析，結(jié)果見表3。在本實驗中，第1～9組為析因?qū)嶒?，?0～12組為中心實驗。析因點和零點構(gòu)成12個實驗點，以析因點為自變量，在A、B、C構(gòu)成的三維空間中取值，區(qū)域的中心作為零點，重復(fù)3次零點實驗來估計實驗誤差。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

利用Design－Expert 8.0.6軟件對表2中所得的實驗數(shù)據(jù)進行分析，以總峰面積Y對自變量進行模型擬合，通過決定系數(shù)(R2)和方差分析對擬合模型進行評價，通過比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項回歸擬合方程:Y=4056.27+447.76A+644.03B+228.56C+198.52AB+343.65AC－51.17BC－1318.91A2－1210.13B2－1291.36C2

對模型進行二項式模型的ANOVA方差分析［22］見表4。從方差分析和決定系數(shù)來考察模型的可靠性。由表4中可知，模型p＜0.001，表明回歸方程呈極顯著，在統(tǒng)計學上有意義;失擬項p=0.0577(＞0.05)不顯著;該模型R2=0.9428，表明這種方法可靠，該方程模擬真實分析有現(xiàn)實意義;因子B和模擬項的二次項 A2、B2、C2值達到了極顯著水平(p＜0.001)，因子A和因子C以及因子AC也達到了顯著水平(p＜0.05);結(jié)合F值可以看出，3個因素對總峰面積的影響順序分別為:B＞A＞C;該模型=0.9643，說明該模型實驗擬合度好。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

2.2.3 響應(yīng)面曲面分析 采用Design－expert 8.6.0軟件對實驗結(jié)果進行分析，作出響應(yīng)面的3D和等高線分析圖，可以形象地反應(yīng)出各自變量對總峰面積的影響。由圖4～圖6可知，在所選范圍內(nèi)存在極值即響應(yīng)面最高點，也是等值線最小橢圓的中心點，曲面坡度大，說明變化明顯;響應(yīng)面圖能較直觀反映出各因素與響應(yīng)值的關(guān)系及各個因素間的交互作用，由圖4～圖6中可知，水解時間與三氟乙酸用量這兩者之間存在顯著的交互作用。而水解時間和水解溫度之間無顯著交互作用，水解溫度和三氟乙酸用量之間也無顯著交互作用，與方差分析結(jié)果一致。

圖4 水解溫度和水解時間對總峰面積影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of the effect of hydrolysis temperature and hydrolysis time on total peak area

2.3 驗證試驗

響應(yīng)面試驗預(yù)測的最佳水解條件為:水解時間8.75 h，水解溫度109.19℃，三氟乙酸用量3.20 mL，模型預(yù)測值為4162.26。為了檢驗?zāi)Ｐ偷目尚行?，考察預(yù)測結(jié)果的可靠性，在優(yōu)化的工藝參數(shù)下進行驗證實驗，考慮到實際操作條件，實際校正后將最佳工藝參數(shù)修正為:水解時間9 h，水解溫度110℃，三氟乙酸用量3 mL。在優(yōu)化條件下，每個單糖的峰面積為:半乳糖1630.03，葡萄糖921.28，甘露糖482.27，木糖425.03，鼠李糖312.87，阿拉伯糖263.03，果糖116.84，所得總峰面積為4151.35，與模型預(yù)測值相對誤差為0.26%，接近且略低于預(yù)測值(所得數(shù)值均為三次實驗數(shù)據(jù)所選取的平均值);由此證明實驗?zāi)Ｐ秃侠?，在?yōu)化條件下實驗結(jié)果理想。圖7為優(yōu)化條件下進行的樣品及標準單糖氣相色譜圖。因此，采用響應(yīng)面試驗對野菊花多糖水解條件進行優(yōu)化是可行的。

圖5 三氟乙酸用量和水解時間對總峰面積影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the effect of the amount of trifluoroacetic acid and the hydrolysis time on the total peak area

圖6 三氟乙酸用量和水解溫度對總峰面積影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the effect of the amount of trifluoroacetic acid and the hydrolysis temperature on the total peak area

圖7 標準單糖和樣品氣相色譜圖Fig.7 Standard monosaccharide and sample GCchromatogram注:a:標準單糖衍生物;b:樣品衍生物。

3 討論與結(jié)論

本實驗考慮到野菊花多糖的完全水解條件，采取將多糖水解后的產(chǎn)物進行PMP柱前衍生化，后經(jīng)氣相分析進行單糖測定來評測多糖是否水解完全，選取單糖總峰面積作為響應(yīng)值也能準確反映出野菊花多糖水解的完全程度。陸穎等［23］在野菊花多糖和金紅英等［24］人在野菊花中性多糖的研究中均發(fā)現(xiàn)了6種單糖，未發(fā)現(xiàn)果糖，與本實驗結(jié)果有差異;可能與其未完全水解野菊花多糖和用糖腈乙酸酯衍生化法衍生有關(guān)，其他原因有待進一步研究。本文最終確定的最佳水解工藝為:水解時間9 h，水解溫度110℃，三氟乙酸用量3 mL，且在該水解條件下經(jīng)過氣相色譜測得的總峰面積最大，為4151.35，與模型預(yù)測值相對誤差為0.26%。本實驗將水解程度與氣相色譜峰面積相結(jié)合，簡便、快捷、穩(wěn)定地評價水解程度;研究結(jié)果為基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)和單糖組分的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。