施 敏，管 敏

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

上感合劑是我院針對(duì)上呼吸道感染、發(fā)熱研制的醫(yī)院制劑，由羌活、薄荷、柴胡、黃芩、青蒿、生石膏、大青葉、鴨跖草、甘草9味藥材組方，具有清熱透表的功效。處方以黃芩和柴胡為君藥，清解邪熱；薄荷、羌活、青蒿、生石膏同為臣藥，解肌除煩，利咽止痛；大青葉、鴨跖草為佐藥，清熱解毒瀉火。全方共奏衛(wèi)氣同治、清熱透表之功效［1］。是我院奚肇慶教授的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用30多年，療效確切。上感合劑擴(kuò)大了其中醫(yī)中藥的適應(yīng)證，使用方便，退熱作用迅速而持久，適用于內(nèi)科、兒科的臨床急診和危重癥。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)該制劑中的羌活、大青葉、甘草3味藥材進(jìn)行了定性鑒別，并采用高效液相色譜法對(duì)該制劑中君藥黃芩中的主要成分黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，建立上感合劑的定性、定量標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型安捷倫高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AX2247H／E OHAUS型電子天平（千分之一，常州奧豪斯儀器有限公司）；BP211D型賽多利斯天平（萬分之一，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；薄層層析硅膠G板（青島海洋化工廠分廠，批號(hào)為20160712；煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司，批號(hào)為20160503）。

1.2 試藥

羌活（批號(hào)為 160901），黃芩（批號(hào)為 160401），大青葉（批號(hào)為 150301），甘草（批號(hào)為 161101），薄荷（批號(hào)為 160601），柴 胡 （批號(hào) 為 161001），青 蒿 （批 號(hào)為161201），生石膏（批號(hào)為 161201），鴨跖草（批號(hào)為160401），均購自安徽省萬生中藥飲片有限公司；靛玉紅對(duì)照品（批號(hào)為0717-200003），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110781-201213），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)為 120904-201318），羌活對(duì)照藥材（批號(hào)為 120935-201413），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜級(jí)），水為超純水，其他試劑均為分析純；上感合劑（江蘇省中醫(yī)院制劑部，批號(hào)分別為 170701，170702，170703）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

羌活：依據(jù)2015年版《中國藥典（一部）》羌活項(xiàng)下鑒別方法［2］進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。取上感合劑（批號(hào)為170701）20 mL（相當(dāng)于羌活藥材1 g），蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL，超聲處理30 min，過濾，得上清液，濃縮至5 mL，作為供試品溶液；另取羌活對(duì)照藥材1 g，同供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液；取不含羌活的陰性對(duì)照溶液20 mL，同法制備陰性對(duì)照品溶液。硅膠G薄層板噴適量3% 醋酸鈉溶液，105℃活化1 h，照薄層色譜法，分別吸取上述3種溶液各5 μL，點(diǎn)于含醋酸鈉的薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（8∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，10%硫酸乙醇溶液顯色，105℃加熱3～5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與羌活對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1。

圖1 羌活的薄層色譜圖

大青葉：取上感合劑（批號(hào)為170701）10 mL（約相當(dāng)于大青葉藥材0.5 g），加三氯甲烷20 mL，水浴加熱回流1 h，放冷使分層，取三氯甲烷層，濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取靛玉紅對(duì)照品，加三氯甲烷制成質(zhì)量濃度為1 g／L的溶液，作為對(duì)照品溶液；取不含大青葉的陰性對(duì)照溶液10 mL，依法制備陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法，分別吸取上述3種溶液各5 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，5 min內(nèi)盡快觀察。供試品溶液色譜中，在與靛玉紅溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同的淺紫紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖2。

圖2 大青葉的薄層色譜圖

甘草：取上感合劑（批號(hào)為170701）25 mL（相當(dāng)于甘草藥材1 g），用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇層蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取甘草對(duì)照藥材1 g，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，而后同供試品溶液制備方法制備甘草對(duì)照藥材溶液。另取不含甘草的陰性溶液25 mL，同法制備甘草陰性對(duì)照品溶液。硅膠G薄層板噴適量1%氫氧化鈉溶液，105℃活化1 h，照薄層色譜法，分別吸取上述3種溶液各5 μL，點(diǎn)于含氫氧化鈉的薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱5 min，紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與甘草對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖3。

圖3 甘草的薄層色譜圖

2.2 黃芩苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.2%磷酸溶液（47 ∶53）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

2.2.2 溶液制備

取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含黃芩苷123.0 μg的對(duì)照品溶液。精密吸取樣品溶液1 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲15 min，放冷，補(bǔ)足減失的甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，濾過，制得供試品溶液。取缺黃芩的陰性制劑，按供試品溶液制備方法制備缺黃芩的陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：按擬訂色譜條件，測(cè)定黃芩苷對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺黃芩陰性對(duì)照品溶液的色譜圖，結(jié)果見圖4。可見，黃芩苷的色譜峰理論板數(shù)、分離度、拖尾因子均符合要求，陰性對(duì)照無干擾。

線性關(guān)系考察：取黃芩苷對(duì)照品溶液，依次稀釋2，4，8，16，32 倍。精密吸取上述對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣10 μL。以黃芩苷的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷的回歸方程Y＝25.65X-14.823（r2＝0.999 9），線 性 范 圍 為3.85 ～ 123.00 μg ／mL。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄黃芩苷對(duì)照品峰面積。結(jié)果的RSD為0.10%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：平行量取同一批（批號(hào)為170701）樣品，共6份，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為1.98%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

圖4 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算峰面積。結(jié)果的RSD為1.28%（＜5%，n＝7），表明供試品溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知質(zhì)量濃度的供試品溶液6份，每份1 mL，置100 mL容量瓶中，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液，超聲15 min，放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻，過 0.45 μm 濾膜，濾過，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

分別取不同樣品3批，依法制備供試品溶液，每批取3份，依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果批號(hào)為170701，170702，170703的樣品中，每瓶黃芩苷含量分別為753.38，750.27，759.42 mg，RSD為 0.97% （n＝3）。

3 討論

3.1 薄層鑒別法定性藥材選擇

羌活的薄層鑒別參考2015年版《中國藥典（一部）》方法［2］，并作了適當(dāng)改進(jìn)，薄層板展開晾干后在紫外光燈（365 nm）下觀察，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)不夠清晰，不易于觀察，故增加10%硫酸乙醇顯色，烘烤后，斑點(diǎn)更清晰。以羌活對(duì)照藥材為對(duì)照，增強(qiáng)了定性鑒別的準(zhǔn)確性與可靠性，能較好地控制上感合劑的質(zhì)量。大青葉的薄層鑒別參考2015年版《中國藥典（一部）》方法，對(duì)照品靛玉紅顯色清晰，有明顯鑒別點(diǎn)，因靛玉紅空氣中不穩(wěn)定，易分解［3］，靛玉紅紫紅色斑點(diǎn)會(huì)逐漸變淡，取出晾干后應(yīng)盡快觀察拍照。甘草的薄層鑒別參考2015年版《中國藥典（一部）》方法［2］，嘗試以甘草酸銨為對(duì)照，但甘草酸銨顯色需加熱較長(zhǎng)時(shí)間，點(diǎn)樣量小顯色不明顯，量大容易拖尾，使用甘草對(duì)照藥材后，斑點(diǎn)清晰，且定性鑒別的成分信息更加豐富。

方中其他藥材薄荷、柴胡、青蒿、鴨跖草薄層鑒別采用藥典方法［2］和文獻(xiàn)［4-6］中的相關(guān)方法均不能得到理想結(jié)果。薄荷的鑒別中，供試品溶液中無與薄荷對(duì)照藥材溶液相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，可能是薄荷在方中含量較少，且在煎煮和濃縮過程中揮發(fā)性成分有所損失。柴胡的鑒別方法學(xué)考察時(shí)，陰性對(duì)照有干擾，調(diào)整展開劑比例后，干擾仍存在，可能是方中有極性相近成分。青蒿和鴨跖草的鑒別中，供試品溶液中鑒別點(diǎn)沒有或不清晰。故上述4味中藥的定性鑒別未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 高效液相色譜法定量指標(biāo)選擇

黃芩是該方君藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩苷具有抗病毒、抗菌消炎等多重作用［6］，與該方的治療目的相一致，故以黃芩苷作為上感合劑含量測(cè)定指標(biāo)，參考2015年版《中國藥典（一部）》黃芩項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，對(duì)供試品溶液超聲時(shí)間進(jìn)行考察，分別超聲15，30，45 min，結(jié)果黃芩苷含量無明顯差異，故確定供試品溶液制備方法為“樣品溶液1 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲15 min”。

3.3 不足

中藥制劑一般含藥味較多，成分復(fù)雜。因此，薄層鑒別中僅以化學(xué)物質(zhì)作為對(duì)照難以鑒別各味藥材，特別是對(duì)照品為其非專屬性成分時(shí)，更加難以判斷所顯示的斑點(diǎn)是否源于該藥材，故在本研究中采用對(duì)照藥材作參照，可供鑒別的信息更豐富，提高鑒別結(jié)果的可靠性?，F(xiàn)行制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂模式中，含量測(cè)定指標(biāo)的選擇多考慮主要成分、易得、易測(cè)、穩(wěn)定等因素［7-9］，許多制劑的指標(biāo)成分與藥效的發(fā)揮是否有直接關(guān)系并不確定，故并不能完全代表制劑的質(zhì)量。在未來中藥及中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究過程中，必將逐漸采用“多組分”“質(zhì)量標(biāo)志物”等為指標(biāo)綜合控制中藥及中藥制劑的質(zhì)量，體現(xiàn)中藥的整體性和系統(tǒng)性。